免疫组化方法和步骤

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1、免疫组化方法和步骤免疫组化检测CD34+的表达1基本原理 免疫组化，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与 抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白 质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术 （immunohistochemistry） 或 免 疫 细 胞 化 学 技 术 （immunocytochemistry）。威斯腾生物 400-675-6758（1 ） IxPBS （ pH 7.4 ,2.5L=20.0157g137mMNaCl+0.499552g2.68mMKCl+0.500130

2、75g1.47mMKH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4）,115Cx15 min;（2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml 三蒸水， 115 Cx15 min；（3 ） 4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 C 水箱中3 h多，再放入4 C保存。（4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2；（5）Proteinase K buffer ：1 0 0 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50

3、mM EDTA；（6 ） DNase 1 （原液 1000 U/ml 按 1 : 99DNase 1 缓冲液稀释 至10 U/ml）；（ 7 ） DAB 工 作 液 （ 临 用 前 配 制 ， 5ul 20xDAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS）（8）20 pg/ml Proteinase K 工作液（按 1: 500 稀释贮存液 1 mg/ml）。（9）另外，双蒸水、无菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、 95、85、70、50%）、苏木素。2主要仪器设备电热压力蒸汽消毒器(XDD)浙江绍兴医疗器械总厂 超净工作台苏州净化设备公司TC2323型C02恒温孵箱美国SH

4、EL LAB公司 恒温烤箱上海跃进医疗器械厂高速台式离心机(BACKMAN CS-15R)美国Beckman公司 抽滤器(AUTOSCIENCE AP-01)上海 磁力搅拌器(79-1)江苏江阴科研器械厂0.22um纤维素滤膜德国BM公司0.45um混合纤维素滤膜德国BM公司1/10000 电子天枰(Sartorius AC-211)德国细胞培养瓶及细胞培养板(Costar)美国 细胞计数板上海医用仪器厂光学显微镜(OLYMPUS CK-40)日本倒置显微镜(OLYMPUS)日本照像系统(OLYMPUS BH-2)日本切片机：德国Leica展片机：德国Leica，HI1210型烤片机：德国Le

5、ica，HI1220型3实验方法3.1载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极 易造成脱片。1. APES :现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的 APES 中，停留 2030 秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏 水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应 注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。2. HistogripTM ：将洗净的玻片放入以 1:50 比例丙酮稀释的Histogrip 液中，停留 12 分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。3. Poly-L

6、-Lysi ne:将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子 水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备 用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。3.2常用酶消化:1）胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%0.1%，消化时间为37弋、 1040分钟，主要用于细胞内抗原的显示。2 ）胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37弋、 30180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin （层粘蛋 白），Collagen IV（IV型胶原）等。3 ）皂素（Saponin ）:般使用浓度为210 g/ml的saponin 溶液，消化时间为室温孵育30分钟

7、。3.3抗原热修复可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修 复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、 重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0 ） 效果最好。3.3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后， 3 H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟x3o将切片放入盛有枸橼酸盐 缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持 在92弋98弋之间并持续1015分钟（注意：无论是使用医用或家用 微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度 和时间的要求）。取出容器，室温冷却1020分钟（注

8、意：不可将切 片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.3.2石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将 1500ml3000ml 的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中 加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下， 盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热56分钟后），计时12 分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打 开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟x3,下接免疫组化染 色步骤。3.3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放 入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并

9、将此容器置于盛有一 定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达 92弋98弋起开始计时152 0分钟，然后端离电炉，室温冷却2030 分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。3.3免疫组化染色步骤：1、石蜡切片脱蜡，100%二甲苯10minX 2,50%二甲苯5min。2、复水：无水乙醇5minX 2 ; 95%乙醇5min ; 90%乙醇5min ; 80%乙醇5min ; 70%乙醇5min，蒸馏水洗涤5min。3、3%H2O2室温孵育15分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。4、PBS浸泡5分钟x3次5、抗原修复：加入0.2%Triton X-100室温下4分钟，

10、弃去液体， 0.5%Triton X-100室温下10分钟，PBS冲洗，5分钟x3次。6、6%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育20分钟。倾去 血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37弋孵育12 小时或4弋过夜。7、PBS浸泡5分钟x3次。&滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释）， 37弋孵育30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37弋或室 温孵育30分钟。9、PBS冲洗，5分钟x3次。10、滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释）， 37弋孵育1030分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37弋 或室温孵育1030分钟。11、PBS冲洗，5分钟x3次。12、显色剂显色：DAB显色（避光，镜下观察至棕色）13、PBS 洗 2 次 5 min。14、苏木素复染 0.51min15、自来水洗返蓝。100%各 3min。16、梯度酒精脱水 75，85，17、二甲苯透明2次 3min18、中性树胶封片。