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1、REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化摘要：为了构建限制性内切酶介导的整合(remi )技术介导 的红曲霉(monascus anka)遗传转化系统，以潮霉素b 作为抗性筛选标记，pbchygro、pcbl003、pa n7- 1作为转化质粒，采用remi技术转化红曲霉。结果表明， 用remi技术介导红曲霉转化时，质粒pbc-hygro和p cb1003适合于红曲霉的转化。环状质粒与线性质粒的转化率 无显著差别；在用remi技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于 转化；原生质体浓度为1X1071X108个/ml时，每微 克质粒可获得的潮霉素b抗性转化子为2 8 0 03 2 0 0个； hindii
2、i介导转化时的最佳酶用量为10512 0 u；在质粒 用量为8 p g/100 p l时转化率最高。关键词：红曲霉(monascus anka)；遗传转化；限制性 内切酶介导的整合(remi)abstract： to establish a geneti c transformation system of mon ascus anka by restriction enzyme -mediated integration(remi) u sing the hph gene as selectable marker and pbc-hygro， pcb 1 0 0 3 a nd pan7-1
3、as vector， the fungus一论文发表专家一 国J中国掌木期刊网 而 wangnel m. anka was transformed to be hy gromycin bresistant by remi. a ddition of restriction enzymes to transformationmixtures res ulted in increase of transform ation rate when using pbchygr o and pcbl 0 0 3 as vectors. the tr ansformation rate had no sig
4、ni ficant difference no matter if vectors were digested by restr iction enzyme or not. addition of enzyme digestion buffer res ulted in reducing of transform ation. protoplasts at the concen tration of 1X1071X108 ml were fit for transforming m. anka, t ransformation number was 2 80 03 2 0 0 ind./|j
5、g vector dna. the optimum hind iii and vector dos e was 105120 u and 8 p g/100 p l, respectively.key words：monascus sp.； geneti c transformation； restriction enzyme-mediated integration(r emi)限制性内切酶介导的整合(restriction e nzym e-mediated dna integration,rem i)技术是将dna转化进入真核细胞，并产生非同源整合的一种 方法rem i的非同源整合机理与
6、非同源末端连接(nonho mologous end joining,nhej)相关1 4,整合的过程5可简单归结为三步：首先在转化过程中 使线性化dna的酶随线性化dna进入核内；第二，限制性内切 酶在特定识别位点酶切宿主染色体dna ；第三，染色体dna和 转化片段在体内互补末端连接产生非同源整合事件。1991年schiestl等6首次将r emi技术应用 于极易同源整合的saccharomyces cerevis iaeokuspa等7首先将remi技术应用于dict yostelium discoidium克隆发育基因，构建 了 remi rflp(限制性片段长度多态性)图谱】8，9
7、并克隆了很多发育基因，使发育途径的研究变得更加容易。应用该 方法已分离到几个植物致病真菌的毒力因子5。remi技术 还成功应用于子囊菌cochliobolus heteros盛峰一论文发表专家一 雁I中国掌木期刊网 trophusl 0和玉米致病真菌ustilagoma ydisll、 aspergillus nidulans 12的遗传互补分析，以及启动子捕获等。研究探讨了不同限制性内切酶介导转化红曲霉的能力，以及酶切 缓冲液和不同质粒对转化率的影响，同时优化了酶的用量、受体细 胞浓度等条件。1材料与方法1.1材料1.1.1 菌株、质粒与培养基菌株m 7 5 7 7是野生型红 曲霉（mona
8、scus anka）,由贵州大学真菌资源研究所 分离、保存。用于遗传转化的质粒pbchygro由法国silar教授 惠赠，该质粒携带潮霉素b抗性基因（hph ）13,是用限制 性内切酶hindiii酶切线性化的。质粒pan7 114 带有来自a. nidulans的g pd基因的启动子和trpc基因15的终止子。用hphi 酶切质粒pan52 1，用t4 dna聚合酶补平末端，再用 bamhi酶切得到1 .1 kb hph基因片段（hph基因缺 失了不影响酶功能的前3个密码子）16，与a. nidul ans带有起始密码子atg的gpd基因5端融合；hph 基因下游密码子区域与a. nidul
9、ans trpc基因末端区域的hphibamhi片段融合，克隆到质粒pan52 1(克隆前先用neo i酶切pan52 1,用t4dna聚 合酶补平末端，再用bam h i酶切)上构建得到pan7 1。质粒peb 1 0 0 3带有来自pcsn4317 的2.4k b sal i片段(含有潮霉素b抗性基因hph和来自a.ni dulans的trpc启动子和终止子)通过单个碱基的改良 消除了 hph基因中的4个限制性内切酶位点：ecori(ga gttc)、psti(ctggag)、sstn(ccgcgc) 和bam hi (ggttcc),但hph基因编码的氨基酸序 列未变。通过pcr技术消除
10、trpc终止子，获得了1 .4k b的片段，并在片段两端引入ecori、sal i和hpai位 点，最后通过ecori位点亚克隆到puc19构建得到pcb1 0 0 3。菌丝生长的cm培养基和产孢培养基按文献18配制，原生 质体再生液体和固体培养基是分别于cm液体和琼脂糖固体培养 基中加入蔗糖，终浓度为0.6 mol/l；复苏液体培养基、 马铃薯葡萄糖液体培养基中加蔗糖，终浓度为0.6 mol/l。1.1.2药品与试剂 各种限制性内切酶和pfu dna聚 合酶为f ermentas 公司产品，cellulase、lysing enzyme 购于 sigma 公司，snailase 购于华美生物
11、工程公司，琼脂糖购于biowest公司，质粒中 量制备试剂盒为德国qiagen公司产品，其余试剂均为进口或 国产分析纯。电击转化缓冲液i含有10 mmol/1 trishc!(ph 7. 5)、600 mmol/1 蔗糖、1 mmol/1 1 iac，用于不含聚乙二醇4 0 0 0的原生质体电击转化；电击 转化缓冲液ii含有10 mmol/1 trishc1(ph7. 5)、6 0 0 mmo1/1 蔗糖、1 mmo1/1 1iac、3 0 0 g/1聚乙二醇4 0 0 0，用于含聚乙二醇4 0 0 0的 原生质体电击转化；电击转化缓冲液iii含有10mmo1/1 t rishc1(ph 7.
12、 5)、270 mmo1/1 蔗糖、1 m mo1/1 1iac，用于萌发孢子的电击转化。stc溶液含有1 mo1/1山梨醇、50mmo1/1 tr ishc1(ph 8.0)、50 mmo1/1 cac12， ptc溶液含有4 0 0 g/1聚乙二醇4 000、50mmo 1/1 trishc1(ph8.0)、50 mmo1/1 c ac12o1.2 方法1.2.1原生质体的制备 参考文献19。菌株m 7 5 7 7 在产孢培养基上于3 0 P培养710 d，收集孢子并制备成均 一的浓度为1X1081X109个/m1的孢子悬液。取2 0 0 1孢子悬液涂布于铺有玻璃纸的pda平板上，于30C
13、 培养3 0 h,收集菌丝体，用lmol/1 mgso4溶液洗 1次。约3 0 0 mg菌丝体加3 0ml裂解酶液，于30 P以 6 0 r/min酶解23 h，过滤，滤液于4 C、以3 20 0 r/min 离心10 min。弃上清，用1. 2 mol/l 预冷的山梨醇溶液洗原生质体沉淀2次，分为2份。一份重悬于 1.2 mol/l预冷的山梨醇溶液中，一份用预冷的stc溶 液洗1次。两份样品均置于冰浴备用。1.2.2质粒的线性化 用hindiii酶切线性化质粒pb chygro。酶切反应体系：36 p l 10Xenzyme buffer，20 p g pbchygro，12 p l 10
14、u/ p l hindiii，加 ddh2。至 3 6 0 p l，置于 37 C 水浴24 h，于6 5 C水浴反应15 min，停止反应，然 后分为2份，一份备用，称为质粒a液；另一份用苯酚一氯仿抽提 纯化，然后溶解于无菌去离子水，称为质粒b液。1.2.3 remi技术的转化方法 参考文献20。用预冷 的stc溶液洗原生质体并再重悬，浓度调整至5X107个/m l。取10 0 p l转化用原生质体液，加入1 p g环状质粒pb chygro，轻轻吹吸混匀；分别加限制性内切酶hindiii 3 019 0 u，冰浴3 0 min，加1ml ptc，于室温 静置4 06 0 min，涂布于含有
15、120 p g/ml潮霉素b 的再生琼脂糖固体培养基平板上，每个平板涂布2 0 0 p l转化 液。于3 0 C暗培养45 d,统计转化子数。1.2.4最适质粒的选择 采用3个启动子序列来源不同的 环状质粒 pbchygro、pcb1003、pan7 1, 用量为7 5或10 5 u的限制性内切酶hindiii、saci、 bamhi，将1 M g不同质粒和限制性内切酶分别加到10 0 M 1 5X107个/ml原生质体中，对红曲霉进行转化试验， 以潮霉素b抗性转化子数为指标评价和筛选适合转化红曲霉的质 粒。1.2.5最适限制性内切酶的选择 选择7种不同的限制性 内切酶为转化质粒，其中平末端酶
16、有smai和hpai,5端 突出末端酶有hindiii、sa1 i和ecori，3端突出末 端酶有kpni、saci，向100 p 1 5X106 个/ml 原生质体液中加入1 p g线性或环状质粒pbchygro和 75 u限制性内切酶进行转化试验，以不加酶处理的作对照，以 潮霉素b抗性转化子数为指标评价和筛选合适的限制性内切酶。1.2.6酶切缓冲液对转化的影响试验 有7种试验方案， 10 0 p 1原生质体液中，加质粒a液和1 0 5u hind iii，加质粒b液、1 0 5u hindiii和10X酶切缓冲液， 加质粒b液和10 5 u hindiii，加环状质粒、1 0 5 u hindiii和10X酶切缓冲液，加环状质粒和1 05 u hin di，加质粒b液，加
