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1、蛋白质的测定方法测定食品中的蛋白质含量有二种方法，一是凯氏微量法，二是自动定氮分析法。一.凯氏微量法有手工滴定定氮和自动定氮仪定氮，实验者可根据经济条件设备而定。1. 原理蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸 结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用过量硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据 酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。2NH2 (CH2) 2COOH+13H2SO4 (NH4) 2SO4+6CO2+12SO2+16H2O(NH4) 2SO4+2NaOH 2NH3+2H2O+Na2SO42. 方法本法参照GB 5009.5 -8
2、5适用于各类食品及饲料中蛋白质的测定3. 试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。试剂均为分析纯。3.1硫酸铜3.2硫酸钾3.3浓硫酸3.4 2%硼酸溶液(或1%的硼酸)3.5混合指示剂：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%漠甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2 份0.1%甲基红乙醇溶与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。3.6饱和氢氧化钠：500g氢氧化钠加入500ml水中，搅拌溶解，冷却后放置数日，澄清后使用。3.7 0.01mol/L或0.05mol/L盐酸标准溶液：需标定后使用(配制及标定方法见附录)4. 仪器消化炉 凯氏定氮蒸馏装置 万分之一电子天平凯氏定氮蒸馏装置：如图所示5.
3、操作步骤5.1样品处理:精密称取0.12.0g固体样品或25g半固体样品或吸取液体样品520ml，放入100ml 或500ml凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜，0.3g硫酸钾及320ml浓硫酸，放置过夜后小心加热， 待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明 后，取下放冷后用约210ml蒸馏水冲洗瓶壁，混匀后继续加热至液体呈蓝绿透明，取下放冷，小 心加1020ml水混匀，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中， 再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白实 验。5.2按图装好定氮装
4、置，于水蒸气发生瓶内装水至约2/3处，加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸， 以保持水呈酸性，加入数粒玻璃 珠以防暴沸，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。5.3向接收瓶内加入10ml ,12%硼酸溶液及混合指示液1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取 10ml样品消化稀释液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使之流入反应室内，塞紧小 玻璃杯的棒状玻璃塞。将310ml饱和氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯中，提起玻璃塞使其缓缓流入反 应室，立即将玻璃塞盖紧，并加水于小玻璃杯中以防漏气。加紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸气通入反应 室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏2min，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，然后用少
5、 量中性水冲洗冷凝管下端外部，再蒸馏1min取下接收瓶，以0.01或0.05mol/L盐酸标准溶液滴定 至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10ml试剂空白消化液按5.3操作。6. 计算X = (V-V0 ) XCX 0.014X B/m X100X F 式中：X 一样品中蛋白质含量，g/100g;V 一样品消耗盐酸标准液的体积，ml;V0 -空白消化液消耗盐酸标准液体积，ml;C 一盐酸标准液摩尔浓度,mol/L;0. 014 一 1mol/L盐酸标准液1 ml相当氮克数.B 一定容体积/取液量m 一样品的质量，g;F 一氮换算为蛋白质计算因子。蛋白质的氮素含量不同，故换算因子不同。详见下表。蛋白
6、质计算因子食物计算因子蛋，鱼，肉及制品，禽类，玉米，高粱，豆类，水果和蔬菜类6.25乳及乳制品6.38大米5.95小麦面普通粉5.70全麦，大麦，燕麦，裸麦，小米，小麦面全麦5.83小麦 5.80黄豆5.71花生5.46芝麻，向日葵，核桃和榛子5.30麸皮6.317. 举例 设取样品0.1000g，消化后稀释至100 ml;。取10 ml样品稀释液，标准盐酸为0.01 mol/L，空 白滴定为0.12 ml;，样品滴定用去的标准盐酸为3.21 ml;，测得样品中蛋白质百分率为：(3.21-0.12)X0.01X0.014X10/0.01X 100X 6.25= (3.21-0.12)X8.75
7、 = 27.0%8. 附录：(1) 标准HCl溶液(0.1 mol/L HCl)配制及标定：配制：量取9毫升HCl，加适量水稀释至1000毫升。标定：精确称取约0.15克左右在270300C干燥至恒重的基准无水碳酸钠，加50毫升水使之溶 解，加10滴漠甲酚绿-甲基红混合指示液，(量取30ml 0.2%漠甲酚绿乙醇溶液，加入20ml 0.1% 甲基红乙醇溶液，混匀)用配制的盐酸滴定至溶液由绿色变紫红色，煮沸2min，冷却至室温，继 续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。同时做试剂空白实验。(2) 计算：C = m(v-v0)X0.0530C - HCl标准滴定溶液的实际浓度,mol/Lm -基准无水碳酸
8、钠的质量,g;v - HCl标准滴定溶液用量,ml;vo -试剂空白HCl标准滴定溶液用量,ml;0.0530-1.00 ml HCl标准滴定溶液C (HCl) =1mol/L相当基准无水碳钠g。0. 01mol/L HCl：精确吸取标定过的0.1mol/L HCl 10 ml，准确稀释至100毫升。必要时重新标 定浓度。9. 注意事项：9.1干样用称量纸称重连纸一同消化，空白管同样放称量纸消化。9.2含糖量高和油脂高的样品消化时容易溢出，加热要缓慢。9.3稀释样品时消化液过热，加水反应猛烈使样品损失；消化液过冷，加水后盐析不溶解。二、自动定氮分析法1. 原理本方法为凯氏微量定氮法，将蛋白质的
9、氮素转化成氨，与硫酸化合成硫酸铵，然后测定氨量。由此 计算出氮素含量，再乘以相应的系数即为蛋白质含量。化学反应式如下： 2NH2(CH2)2COOH+13 H2SO4-(NH4)2 SO4+6CO2+12 SO2+16H2O (NH4)2 SO4+2NaOH-2 NH3+2H2O + Na2SO42. 方法来源GB/T 6432-94本法适用于各种食物和饲料的测定3. 仪器KJELTEC AUTO 1030 ANALYZER （瑞典特卡托公司）40孔消化炉4. 试剂本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水（1）浓硫酸 98% H2SO4（2）凯氏片（催化剂）K2SO4 + Se（3）40%氢
10、氧化钠溶液（NaOH） W/V（4）无水硫酸钠Na2SO4（5）1%硼酸（H3BO4）吸收液称取100g硼酸溶于10L水中。加入100ml漠钾酚绿溶液，再加入70ml甲基红溶液，最后加入3ml 4%氢氧化钠溶液。（6）0.1mol/L盐酸（HCL）标准溶液，标定后使用。5. 操作步骤5.1样品消化：称取一定量的样品于消化管中（半固体样品用称量纸称取），加一粒凯氏片于消化 管中，然后加入5ml浓硫酸，放置过夜，同时做样品空白管。在消化过程中，先用低温消化（防止 高温消化时样品溢出），低温消化1小时后，将温度升到最高档，至消化液无色透明。待消化液冷 却后，加入少量水冲洗消化管内壁，振摇，以免内壁粘
11、有样品以致消化不完全。然后于消化炉上再 消化，直至液体无色透明。放置室温后，加水至25ml，待测。5.2样品定氮：开启1030自动分析仪电源，输入测定时的参数，打开STEAM按钮，产生蒸气5分 钟，同时调节蒸气表，使蒸气表的指针指到NORMAL。最后将消化管装入，关闭安全门，开始自动 定氮。当CYCLE OVER灯亮时，记录滴定结果，打开安全门，进行下一个样品测定。6. 计算蛋白质（g/100g） = （V-V0）XO.O14O1XNXf/mX1OOV：样品消耗盐酸标准液的体积，ml；V0:试剂空白消耗盐酸标准液的体积，ml；N：盐酸标准溶液的摩尔浓度，mol；0.01401： 1mol盐酸标准溶液1ml相当于氮克数f：氮换算为蛋白质的系数（一般样品的系数为6.25）；m：样品的质量，g；7. 注意事项7.1对含糖高的样品或油脂样品在消化过程中必须先低温消化，防止样品溢出，消化所需时间较长。7.2样品的称样量不宜过多，否则试剂消耗多，消化时间长，适宜称样范围在0.052.00g之间。 7.3消化液过冷，在加水时，消化液有盐析出。将消化管放在消化炉上加热，使沉淀溶解。7.4使用自动分析仪时，定氮前，应将管路中的吸收液排出去，因为管路中的吸收液长时间停留会 变色。7.5在产生蒸气的水中加入无水硫酸钠是为了提高水中的电解质。7.6本仪器消耗盐酸标准溶液的用量最佳范围在0.57ml。
