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1、质粒DNA提取-碱变性提取法山东大学生命科学学院08级生命基地2010年10月31日星期日质粒DNA提取碱变性提取法栾一山大南路27号 质粒DNA的提取碱变性提取法实验目的：1 掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。2 掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。仪器和材料； 恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器；1.5ml离心管，50ml离心管；不同型号的的枪尖等。菌体：E.coliDH5 受菌体，具有AMPr标记的质粒PUC19。实验试剂： LB培养基，抗生素，溶液I，溶液II，溶液III，RNase A母液，TE缓冲液，饱和酚等。试验原理：碱裂解法是较常用质粒的提取的方法。其优点是收获率高
2、，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。该方法操作简单，易于操作,一般实验室均可进行。十二烷基磺用于进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA
3、则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等.DNA粗提取所用的三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 M NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸；溶液I：任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠
4、杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果缺少溶液I，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。不过菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。溶液II：是用新鲜
5、的0.4 N的NaOH和2的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提法。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。这一步要记住两点：第
6、一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。溶液III：它加入后就会有大量的沉淀，大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。在1的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了
7、十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被SDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因
8、组DNA一旦发生断裂，只要是50100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了SDS沉淀更充分一点。试验准备：1、 溶液:pH8.0GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L TrisHCl）；2、 溶液：0.2mol/LNaOH(内含1的SD
9、S)，这个用的时候需现配。要新配置溶液是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。3、 溶液：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；4、 异丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1左右，小分子所需PEG浓度高达20。5、 pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTrisHCl，1mmol/L EDTA，其中含 RNA酶 20ug/ml。实验步骤1、 配制LB液体培养基，灭菌枪尖（1000ul/200ul/20ul）、2
10、个50ml离心管，吸管，三角瓶等。2、 把E.coliDH5接种到含20mlLB和氨苄青霉素培养基中，在37摄氏度下，过夜培养。（注意无菌操作，防止杂菌干扰试验。）3、 从摇床中取出过夜培养的细菌，轻轻混匀，取2-3ml菌液转接到含50ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 160r/min振荡培养过夜或至对数生长晚期。（经过一夜的培养，液体培养基底部浑浊，菌体大量沉淀。）4、 先称量50ml灭菌离心管的质量m1，然后取一定量的菌体培养液于其中，7000rpm离心5min，弃上清液，收集菌体。 5、 沉淀中加5ml用冰预冷的溶液I，充分混合（需要剧烈振荡）。7000rpm离心5min，弃上
11、清液，收集菌体。离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。称量其质量m2。（m2-m1是菌体湿重，干燥时使离心管口向下，直到看不见液滴。加入离心管前，混匀菌体。加入溶液I时，一定要打散菌泥）。6、按湿菌体质量：溶液I质量=100mg：1ml的比例加入用冰预冷的溶液I，剧烈震荡，使菌体完全分开。冰浴5min。（打散菌体可用吹吸助溶，或漩涡振荡器。这一步主要是悬浮菌体）7、以二倍溶液I的体积量加入溶液II,慢慢颠倒，使之混匀（切勿剧烈震荡！），将离心管置于冰上5min,此时，溶液粘稠如蛋清。（滴加溶液II时，要逐滴加入，且要轻振溶液使之混匀，整体动作要快，因为强碱在溶液中停留时间不能过长，它也会破坏质粒DN
12、A，如果操作慢时，可适当减少冰浴时间。G-细胞壁薄，所以强碱足以损坏细胞壁，不需要额外添加酶。加入溶液II，轻振后，溶液变得粘稠。）8、以1.5倍溶液I的体积加入冰浴后的溶液III，轻轻颠倒数次混匀，使之在粘稠的细菌裂解物中分布均匀，将离心管置于冰浴5 min 。（加入溶液III后，生成了大量的絮状沉淀，在冰上静置后，沉淀沉在溶液底部。溶液III中和强碱使质粒复性，不可剧烈震荡，可放冰上使它自己混匀。）9、以4，12000rpm离心15min，取上清液于另一新离心管中。（白色沉淀聚集在离心管一侧，上清液澄清。取离心管时，不改变其倾斜度，斜着插进枪尖，切勿触碰下部沉淀，吸取时，计算上清液体积。尽
13、可能多的吸取上清液。）10、向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20下沉降30分钟。（加入上述溶液后，溶液变浑浊，不过浑浊程度明显小于加入溶液III。高浓度的盐有利于质粒的沉降。）11、以12000rpm离心15min，小心倒去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使所有的液体流出。12、向DNA沉淀中加入70%冰乙醇5ml，以12000rpm离心5min，（离心管底部DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上。（加入乙醇时，不打散沉淀洗涤盐分。枪尖深入离心管中，把液体打到沉淀的对面，然后转动离心管，使沉淀被液体覆盖。离心时，小心放置离心管
14、位置，不改变质粒沉降位置，沉淀面朝外。粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色。所以为了完全溶解质粒，在离心管上标记质粒所在位置是必要的。）13、将DNA沉淀溶于1mlTE缓冲液中，转移到一个Eppendorf管中，加入RNase A（纯浓度50ug/ml），37保温1小时。（加入TE溶液溶解质粒时，可以用600ul溶解，400ul冲洗未完全转移的质粒。吹吸助溶时，用黄色枪尖吸取溶液，打在刚刚标记的质粒位置的上面，由于质粒本身黏着，容易产生气泡，枪尖溶液快打完时，不要把枪尖插入溶液中。加入酶后混匀溶液保温。）14、将上述的溶液平均分配到2个1.5ml的微量离心管中，每管0.5ml，分别
15、加入与溶液等体积的饱和苯酚溶液，振荡混匀，以4，7000rpm,离心5min，取上层水相到一洁净的Eppendorf管中。（苯酚是经Tris饱和后的，显黄色。苯酚加入后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，在中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。通过两个离心管液体高度的比较，加入与原来溶液相同体积的苯酚。苯酚加入后，放平离心管，混合均匀。离心后，取离心管时不改变离心管的倾斜角度，用黄色枪尖吸取上层清液。尽可能多的吸取上清液，但不要吸入蛋白质。）15、加入等体积的苯酚/氯仿溶液（1:1），振荡混匀，以4，7000rpm,离心5min，取上清液到一洁净的Eppendorf管中。（此
16、时溶液中已看不到明显的白色沉淀，但相信仍有蛋白质的存在。）16、加入等体积的氯仿溶液，振荡混匀，以4，7000rpm,离心5min，取上清液到一洁净的Eppendorf管中。（苯酚是强的蛋白变性剂，但是苯酚留在质粒溶液中会影响DNA的酶切，它本身易被氧化，会损伤质粒。氯仿也是蛋白变性剂，但是比酚弱，且能溶解质粒中的脂类，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。）17、向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀，-20下沉降30分钟。以12000rpm,离心15min，弃去上清液。（加入高盐和乙醇后，有少量的DNA生成，相对于粗的质粒，含量少了不少。）18、向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，以12000rpm离心5min，（离心管底部DNA沉淀所在
