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1、湖北中医药大学本科生毕业论文 题 目：PCR方法在ApoE基因敲除小鼠 基因型鉴定中的应用 姓 名： 学 号： 专 业： 生物技术 年 级： 2008级 实习单位： 武汉大学心血管病研究所 指导老师： 完成日期： 2012 年 5 月 1 日PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用 作者 肖明瑶 指导者 张艳摘 要 目的 为ApoE基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法 设计两对引物扩增野生型 ApoE基因和ApoE缺陷突变基因的DNA片段，用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用PCR鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的 Southern blot
2、方法检测得到的基因型结果比较。结果 野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。用PCR方法获得的ApoE基因分析结果与经典的Southern blot方法获得的结果完全一致。结论 用PCR方法分析ApoE基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。 关键词 聚合酶链反应 基因型 基因打靶 载脂蛋白E Genotype identification of ApoE Gene Knockout Mice with Polymerase Chain ReactionObjective This study was
3、to explore a simple and quick polymerase chain reaction（PCR）method for genotyping of ApoE knockout mice.Method Two pairs of primers were designed to amplify genomic DNA fragment of wild-type ApoE gene and the same region on ApoE targeting veceor respectively.A gradient PCR strategy was used to test
4、the best annealing temperature. Results A 155bp band was found in wild-type ApoE mice,a 245 bp band in homozygous mutated ApoE mice and both bands in hetemzygous mice.The genotyping results were completely coincided with those from typical Southern blot. Conclusion PCR is a simple,fast and practical
5、 method for the genotyping of ApoE gene knockout mice.Key words Poiymerase Chain Reaction genotype gene targeting ApoE 载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化(atl-rosclerosis，AS)病灶形成。ApoE基因敲除小鼠亦称ApoE基因缺陷小鼠，由美国洛克菲勒大学生化遗传与代谢实验室和北卡罗莱那大学病理遗传实验室应用胚胎干细胞基因敲除
6、(gene knockout)技术于1992年培育成功；这种小鼠无论正常或高脂饮食均可形成严重的高脂血症及AS病灶。此后，各国学者利用ApoE基因敲除小鼠在高脂血症及AS的发病机理和治疗措施等方面做了许多卓有成效的研究。为了深入研究基因敲除小鼠表型的改变，基因敲除动物在用于实验研究前，必须准确、及时地进行基因型鉴定。由于需要鉴定的动物数量多，工作量大，而传统的Southern blot方法费时、昂贵，又涉及同位素可能对环境的污染，不便于进行大规模的动物筛选。我们采用聚台酶链反应(poiymerase chain reaction，PCR)技术分析ApoE基因敲除小鼠基因型，旨在为ApoE基因敲
7、除鼠的基因型鉴定探索一种快捷、准确和廉价的方法，并为其他基因敲除动物的基因型鉴定提供参考。材料与方法1.材料1.1 ApoE基因敲除小鼠 1.2 仪器 PCR仪（BIOMETRA T-GRADIENT THERMOBLOCK、BIONEER）电泳仪（BIO-RAI）、离心机（SIGMA 1-14ED）、离心机（SIGMA 1-14ED）BIO-RAD凝胶成像系统1.3 试剂 GOTAG SYSTEM（PROMEGA）、引物（上海生工）、10*TBE缓冲液(?)、琼脂糖、marker（NEB）、EB、宝生物LA Taq酶、蛋白酶K（Promega）tris-HCL（Amresco分装）、EDTA
8、(Amresco分装)、SDS（国药集团化学试剂有限公司）2.实验方法2.1 PCR引物设计：以正常野生型小鼠ApoE基因组DNA序列为模板，设计第一对引物oIMR0180与oIMR0181 (5GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG 3，5 TGT GAC TTG GGA GCT CTG CAG C 3，以检测小鼠野生型ApoE基因，PCR扩增片段长度为155bp。以ApoE基因打靶载体中取代ApoE基因的新霉素抗性基因cDNA序列为模板，设计第二对引物oIMR0180与oIMR0182 (5GCC TAG CCG AGG GAG AGC CG 3，5GCC GCC CCG A
9、CT GCA TCT 3)，以检测发生缺失突变的HSF1基因，PCR扩增片段长度为245 bp。2.2 采样与消化：剪ApoE基因敲除小鼠脚趾,杂合子小鼠脚趾以及野生型小鼠脚趾各一个，分别放入无菌、号15 ml Eppendorf(EP)管中，加消化缓冲液17ul 和蛋白酶K3ul，置于55空气恒温摇床振摇消化3 h或过夜，然后置PCR仪中99摄氏度5分钟失活SDS，100度失活蛋白酶K，13000r /min离心1min，取上层富含基因组DNA的样品加入500ul无菌水作基因型检测备用。2.3 PCR步骤：取200ul无菌EP管18支，编号1至18，各加入总体积为20ul的PCR混合缓冲液:
10、Reaction ComponentVolume (l)Final ConcentrationTotal Volume (l)ddH2O12.26-12.2610 X AB PCR BufferII1.201.00 X1.2025 mM MgCl20.962.00 mM0.962.5 mM dNTP0.960.20 mM0.9620 uM oIMR01800.300.50 uM0.3020 uM oIMR01810.300.50 uM0.3020 uM oIMR01820.300.50 uM0.305 mM DNA Loading Dye1.660.69 mM1.665 U/ul Taq DN
11、A Polymerase0.060.03 U/ul0.06DNA2.00-2.00放入PCR仪运行以下方案。2.4 PCR梯度方案：各取2ul杂合子基因组的样品加入编号1至9的EP管中，将EP管放入PCR仪，设置以下程序：Step #Temp CTimeNote1943 min-29430 sec-350-7040 sec-4721 minrepeat steps 2-4 for 35 cycles5722 min-将扩增产物电泳，将扩增产物电泳，根据凝胶上清晰条带对应的扩增管号所在PCR仪上的位置，用PCR仪梯度计算功能确定最佳退火温度。2.5 PCR鉴定方案：往10、11、12号EP管加入
12、含杂合子基因组DNA，往15、16、18号EP管加入含野生型基因组DNA，最后向13、14、17号EP管加入含纯合子基因组DNA的待测样本运行以下程序：Step #Temp CTimeNote1943 min-29430 sec-35940 sec-4721 minrepeat steps 2-4 for 35 cycles5722 min-2.6 琼脂糖凝胶电泳： 用1*TBE电泳缓冲液配置1.0琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶冷却至50时加入一滴EB。待凝胶板充分聚合并冷却后，取8ulPCR产物点样，然后180V电压电泳35min，电泳结束后，将琼脂糖凝胶放入凝胶成像系统照相。3.实验结果3.1 P
13、CR梯度方案扩增的ApoE基因敲除鼠杂合子基因组DNA，电泳图像见1图。泳道2、3、4在245bp处有条带但不清晰，在155bp处无特异性条带。泳道5、6在155bp及245bp处均有不清晰的条带。泳道7、8、9、10在155bp及245bp处均有清晰的特异性条带。通过PCR仪的梯度计算功能显示出泳道1至9的退火温度分别为：泳道2为50.0、泳道3为51.2、泳道4为53.4、泳道5为55.2、泳道6为57.3、泳道7为59.3、泳道8为61.5、泳道9为63.9、泳道10为66.6。泳道1和泳道11为100bp maker。3.2 PCR鉴定方案扩增的ApoE基因敲除鼠基因组DNA待测标本，获得清晰度和特异性均较好的电泳图像，见图2泳道5、6、9仅在245bp处有条带，表示其基因型为ApoE基因敲除鼠的突变纯合子。泳道2、3、4在155 bp和245 bp两处均有条带，表示基因型为ApoE基因敲除鼠的杂合子。泳道7、8、10仅在155bp处有条带，表示其基因型为ApoE基因野生型。泳道1和泳道11为100bp maker。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 245bp 155bp图1 梯度PCR扩增的杂合子基因组DNAFlg.1 Heterozygous genomic DNA was amplified by gradient PCR1 2 3 4 5 6 7
