去乙酰组蛋白

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1、组蛋白去乙酰化酶I的ShRNA真核表达质粒构建 Construction of shRNA eucharyotic expression plasmid targeted HDAC I 姜雪莲1、李潇婷1、胡倩倩1、郭志义2（1.河北联合大学生命科学院0 8生物和0 9生物 河北唐山0630002.指导教师河北联合大学医学实验研究中心）摘要目的构建HDAC I的shRNA真核表达质粒。方法应用逆转录PCR方法，检测肺 癌A549细胞系HDAC I的表达情况。设计寡聚核苷酸片段，应用分子生物学技术构 建HDAC I的shRNA表达质粒，测序确认。通过转染A549细胞，应用实时荧光定量 逆转录PC

2、R方法检测其抑制效果。结果A549细胞HDAC 1有表达。构建四个shRNA 质粒，测序正确。抑制效率分别为：76%, 88%, 76%, 90%。结论我们构建了高 效HDAC I的ShRNA表达质粒。关键词：组蛋白去乙酰化酶I； shRNA;质粒Abstract: Objective To construct shRNA eucharyotic expression plasmid targeted HDAC I . Methods the abundance of HDACI mRNA level was detected by RT-PCR in A549 cells. The plas

3、mid was constructed by molecular techniques with the designed oligonucleotide. The plasmid was identified byendoenzyme digestion and PCR, confirmed by DNA sequencing. The inhibitory efficiency was validated by RealTime RT-PCR. Resultsthere are expression of HDACI mRNA in A549 cell line. Endoenzyme d

4、igestion and PCR analysis showed that the patterns and size length of the fragment met the design expectation. The sequence was confirmed by DNA sequencing. RealTime RT-PCR analysis showed that the inhibitory efficiency were76%, 88%, 76%, 90% .Conclusion The shRNA plasmids targeted HDAC I were const

5、ructed successfully.Key words: HDAC I ; shRNA; plasmid组蛋白乙酰化修饰是染色质重塑机制之一，在真核基因表达调控中起着重要作 用1。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDAC）是一类蛋白酶，负责组蛋白 的去乙酰化修饰，和组蛋白乙酰化酶（HAT） 一起共同调控组蛋白的乙酰化程度，对 染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。本研究我们分析肺癌细胞系 A549的HDAC I的表达情况，应用分子生物学技术构建了 HDAC I的ShRNA表达质粒， 并在A549细胞系中进行了抑制效果的检测，为HDAC I机制的深入研究奠

6、定基础。 1材料和方法 1.1材料 A549细胞由本室保存DNA分子量标准为DL2000为Takara公司产品。内切酶BamHI 和Hindlll购自NEB公司。寡核苷酸片段由北京博迈德公司合成：HDAC I的ShRNA寡 聚核苷酸序列：序列 1： 5-ATGAAGCCTCACCGAATCCGCATGACTCA -3;序列 2： 5-ATTTGCTGCTCAACTATGGTCTCTACCGA -3;序列 3： 5/-AATAAGCAGCAGACGGACATCGCTGTGAA -3;序列 4： 5-GTCCAAAGTAATGGAGATGTTCCAGCCTA-3。HDAC I mRNA 检测引物：

7、上游引物：5- GGTCCAAATGCAGGCGATTCCT G-3;下游引物 5- TCGGAGAACTCTTCCTCACAGG -3。内 参照GAPDH引物为：上游引物5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3;下游引物 5-GAAGATGGTGATGGGATTT-3。逆转录酶和扩增PCR试剂为invitrogen产品，实时 荧光定量PCR试剂为Qiagen公司产品。普通PCR仪（PTC-100）为MJ Research公 司产品。实时荧光定量PCR仪为Qiagen公司Rotergene3000型。1. 2方法1.2.1细胞培养和转染质粒转染按Lipofectamine 2000使用说

8、明进行.转染前一天A549细胞以1x105 个/孔的密度接种于12孔细胞培养板，培养24 h后细胞生长至70%80%融合时进 行转染。转染前将培养基换成不含血清的新鲜培养基。每孔加入质粒2 口 g。转染5h 后，置换新鲜培养基培养24h。1.2.2总RNA提取 六孔板每孔加入1ml TRIzol,加入200 口 l氯仿，静置3min，离 心15min,取上清，加入等体积异丙醇，室温静置0min，离心、，用75%乙醇清洗沉淀， 室温静置2min，溶于20 口 l DEPC处理过的水中。1.2.3RT-PCR 分析 逆转录：顷 ldNTP(各 10mMol/L) , 1 口 L50 口 mol/L

9、 Oligo (dT)18, 2 口 g细胞总RNA,加DEPC水至12 口 l, 65 C加热5min,置冰上5min后，加4 口 l 5 倍的第一链合成缓冲液，2 口 l的0.1Mol/L DTT, 40U RNasin, 200U M-MLV逆转录 酶，37 C反应1h, 70 C加热15min灭活逆转录酶。PCR反应条件：94C5min; 94C 变性30 s, 58C退火30 s, 72C延伸30s,循环30次，PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA用)胶浓度为5%。实时荧光定量PCR为98C 15s,58C 20s，循环40次。1.2.1质粒构建pRSShRNA载体BamHI和Hin

10、dlll酶切回收。将BamHI和Hindlll 酶切载体DNA片段顷l与退火的寡聚核苷酸反应物片段以2 口 l混合，加入1.5 口 l 10x 连接反应缓冲液(0.5M Tris-HCl, pH7.8 0.1M MgCl, 0.2M DTT, 10mM AT) 1U T4 DNA连接酶，加双蒸水至15 口 l, 25C水浴连接3h。2寡聚核苷酸退火条件如 下：95C3min,72C 3min, 25C3min。转化大肠杆菌，具体方法如下：10 口 l 5 x KCM(0.5M KCl, 0.15M CaCl , 0.5M MgCl)与连接产物混合，加水至 50 口 l,与 50 口 l感受态大

11、肠杆菌混合，在冰浴中反应220 min，室温10 min,加500 口 l无抗性LB 于37C培养30min。取100 口 l转化的大肠杆菌涂于含有适当抗性的LB琼脂培养板， 37C培养过夜。2结果2.1 A549细胞的HDACI表达。提取A549细胞RNA, RT-PCR扩增。PAGE跑胶EB染色观察，可以看出A549细胞表 达 HDAC I, HDACII 和 HDACIII(图 1 )。图lHDACI、II、IIImRNA在A 5 4 9细胞中的表达水平2.2 shRNA质粒鉴定小量提取待鉴定质粒DNA,经BamHI和Hindlll酶切，选择正确质粒进行DNA 测序来最终确定。由于在构建

12、质粒时候BamHI位点被破坏，因此不能被切开，而Hind 111可以切开，说明质粒构建正确(图2)。HDAC1.1.1 HDACI.1.2 HDAC1.2.1 HDAC1.2.2 HDAC1.3.1 HDAi；1.3.2 HDAC1A1 HDAC1.-L21 2 3 1 2 3 12 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3图2：人HDACI的ShRNA酶切鉴定（1代表未酶切；2代表BamHI酶切；3代表HindIII 酶切）选择阳性克隆测序鉴定，结果正确（图3 ）Target Sequence踌ni a用ntuence图32.3 shRNA质粒抑制效率的检测。取lug四种H

13、DACI的shRNA和阴性对照质粒，转染A549细胞。24h后取样， RT-PCR显示抑制效率分别为：76%, 88% ,76% ,90%;溶解曲线表现为单峰。（图4）内参GAPDHHDAC1HDAC1内参 GAPDH图4 HDACI以及内参GAPDH扩增曲线以及溶解曲线(A为扩增曲线，B为溶解曲线) 3讨论进入后基因组时代，生命科学研究的主要任务是阐明人类基因组所包含基因的 生物功能以及功能表现的分子调控机制。与原核生物不同，在真核生物细胞中，基 因组DNA组装于以核小体为基本单位的染色质纤维中。DNA的序列信息(sequence information)被染色质纤维形成的组装环境所掩盖，只

14、有当染色质结构在细胞内外 环境影响下发生染色质重塑(chromatin remodeling)，使特定基因启动子区高级结 构发生改变，其DNA序列调控功能才得以实现1。组蛋白乙酰化修饰是染色质重塑之一。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是一类蛋白酶2,对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着 重要的作用。一般情况下，组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小 体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合， 激活基因的转录。在癌细胞中，一般HDACs的过度表达导致去乙酰化作用的增强，通 过恢复组蛋白正电荷，从而增加DNA与组蛋

15、白之间的引力，使松弛的核小体变得十 分紧密，抑制包括一些抑癌基因在内的基因表达。RNA干扰(RNA interference， RNAi)是指一种由双链RNA诱发的基因沉默现 象，在基因功能研究，基因表达调控机制研究等领域被广泛研究。RNA干扰现象是 1990年由约根森(Jorgensen)研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的 影响时，意外发现3。在1998年，Andrew Z. Fire等在C.elegans中进行反义RNA 抑制实验时意外地发现，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA反而显示出 了更强的抑制效果，Andrew Z. Fire将这种现象第一次命名为RNA干扰4，

16、并于 2006年获得诺贝尔生理及医学奖。目前应用的RNAi有合成的寡聚核糖核苷酸以及构建载体。前者是使用快捷，但 由于RNA容易降解，所以操作复杂，而且实验不易重复；而后者由于制备成质粒， 因此实验更简洁，重复性好，同时某些载体还可以通过筛选插入细胞基因组DNA形 成稳定转染，使实验更加方便。本研究我们选择后者。小发卡或短发卡 RNA( a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA) 是一段具有紧密发卡环的RNA序列，常被用于RNA干扰沉默靶基因的表达5,6。研 究表明与常用的22mer不同，29mer长度的shRNA的抑制效率更高7。本研究我们 即采用的29mer长度的shRNA设计。目前，商品化的RNAi质粒价格很高，因此自行构