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1、高血压病人单个核细胞线粒体呼吸功能测定及意义黎鹏N王滨2郎红梅2李强2高鹏2刘道燕2祝之明2(,遵义，遵义医学院临床医学研究所；2400042,重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所高血压内分泌科，全军高血压代谢病中心，重庆市高血压研究所)摘要目的用OXygraPh-2K线粒体呼吸功能测定仪对于高血压病人单个核细胞线粒体呼吸功能进行检测。方法应用OXygraPh-2K线粒体呼吸功能测定仪，建立测定单个核细胞线粒体呼吸功能的方法，并运用该方法分别检测正常对照组和高血压组的单个核细胞的线粒体呼吸功能。结果纳入高血压病人和正常对照组的健康志愿者各20例，静脉穿刺抽取外周血并分离单个核细胞，利用建立
2、的方案对于线粒体呼吸功能进行高分辨率测定，结果提示高血压组基态呼吸(R)、CIOXPHos、CIIoxphosCI+I1oxphos(P)、C1+1Iets(E)明显低于正常对照组。结论通过运用高分辨率线粒体呼吸功能测定的方法首次证明高血压病人的细胞线粒体呼吸功能降低，进而可以进一步阐明线粒体呼吸功能异常在疾病发生中的意义。关键词：高血压；单个核细胞；线粒体；呼吸功能测定基金项目国家重点基础研究发展计划(973)(2013CB531205)通讯作者祝之明，电子邮箱：Mitochondrialrespiratoryfunctiondetectionofhumanperipheralbloodmo
3、nonuclearcellsinpatientswithhypertensionLiPeng1,2,WangBin2,LangHongmei2,LiQiang2,GaoPeng2,LiuDaoyan2,ZhuZhiming2(1.InstituteofClinicalMedicineResearch,ZunyiMedicalcollege,Zunyi,Guizhou,563000,China;2.CenterforHypertensionandMetabolicDiseases,DepartmentofHypertensionandEndocrinology,ChongqingInstitut
4、eofHypertension,InstituteofSurgeryResearch,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400042,China)AbstractObjectiveTodetectthemitochondrialrespiratoryfunctionsofhumanperipheralbloodmononuclearcellsinhypertensivepatientsbyOxygraph-2K.MethodsDetectingthehumanmononuclearcellsmitochondrial
5、respiratoryfunctionsinpatientswithhypertensionandhealthycontrolsbyOxygraph-2K.Results40subjectswereenrolledinourstudy,andtheyweredividedbybloodpressuretoformhypertensivegroup(n=20)andcontrolgroup(n=20).Afterobtainingthebloodmononuclearcells,high-resolutionmitochondrialrespiratoryfunctionaldetectionw
6、asperformedbyourestablishedmethod.Theresultsshowedthatcomparedwithnormalcontrols,thevaluesofRCR,Routinerespiratoryrate,CIoxphos,CIIoxphos,CI+IIoxphosandCIIetsinhypertensiongroupweresignificantlyreduced.ConclusionMitochondriarespiratoryfunctionsinhypertensivepatientswerereducedcomparedwithnormalcontr
7、olsusingOxygraph-2Ksystem.Thismethodcanbeappliedfordetectionthemitochondriarespiratoryfunctioninothertissuesorcellsandmayhelpfurtherelucidatethemechanismsofmitochondrialrespiratorydysfunctionsinotherdiseases.KeyWordsJhypertension;bloodmononuclearcells;mitochondria;respirometry.线粒体是真核细胞进行氧化代谢的部位，是三大营
8、养物质最终氧化分解的细胞器，是细胞内产生能量的主要场所，在细胞信号传导、细胞分化、细胞死亡山发挥重要作用。线粒体呼吸功能检测是线粒体功能检测重要指标之一，现阶段很多疾病与线粒体呼吸功能异常有关，传统检测人的线粒体呼吸功能检测通常是有创的，主要用于活组织线粒体呼吸功能的检测，因此在人体的研究中很受限。外周血单核细胞(PeriPheraIbIOOdmononuclearcell,PBMC)是机体免疫系统的重要组成部分，是一类重要的介导应激和炎症，通过分泌细胞因子、趋化因子以及生长因子从而参与组织和细胞的病理生理过程的细胞。在糖尿病、败血症、抑郁症等疾病的发生发展中起重要作用，而且是一种可从人外周血
9、中轻易提取，不易对人体造成伤害的细胞。现阶段评价线粒体呼吸功能的方法很多，主要包括Clark氧电极基础上建立的方法和Sea-horse公司的MUltiWelI系统基础上建立的方法。Multiwell系统是用来进行高通量筛选，结果是半定量，只能得到相对的值；而且每个孔最多进行四次滴定，运行成本较高，不适用于SUlT实验和氧化磷酸化分析。而OXygniPh-2k氧电极是国际公认的高精确的CIark电极，是最先进的完全定量的高分辨呼吸测定仪，能够最大的提高呼吸的灵敏度和精确度，运行成本低廉，可以通过SUrr实验进行氧化磷酸化能力分析和高分辨呼吸测定，是研究线粒体呼吸功能最佳选择之一。高血压作为代谢综
10、合征的一个重要的组成部分，它的病因、治疗以及预防一直是研究的热点，因此阐明线粒体功能异常可能为高血压的防治提供一个可能的靶点。本研究利用临床病例标本，通过建立方法对于单个核细胞的线粒体呼吸功能进行测定，阐明了高血压病人的线粒体呼吸功能降低。1材料与方法：1.1 实验仪器及试剂1.1.1 实验仪器PB-21PH计购自德国赛多利斯科学仪器公司，湘仪L600低速离心机购自山东济南博华仪器设备公司，实验室超纯水机MaSter-SUF购自美国HrrECH公司，电子天平BS-124S购自德国赛多利斯公司，显微镜购自ECLIPSEElOO日本尼康公司，高分辨率线粒体呼吸功能测试仪0xygraph-2k购自奥
11、地利OROBOROS公司。1L2试剂FiCOIl分离液、抗坏血酸盐、苹果酸、谷氨酸钠、细胞色素C、ADP、琥珀酸盐、TMPD,寡霉素、抗霉素A、FCCP.鱼藤酮、叠氮化钠、洋地黄皂首、HEPES牛磺酸，台盼蓝均购自Sigma公司；无水乙醇、EGTA.六水氯化镁、蔗糖、牛血清白蛋白、乳糖酸、氢氧化钾均为分析纯。12缓冲液的配置MiRo5液闻：0.5M乳糖醛酸钾储存液：称取35.83g葡萄糖醛酸，取IOOml去离子水充分搅拌，用氢氧化钾溶液调节PH到7.0,然后用去离子水定容至200ml,密封4保存。称取0.19gEGTA,0.610g六水氯化镁，12OmI的0.5M的乳糖醛酸钾储存液,2.502
12、g牛磺酸，L361g磷酸二氢钾，4.77gHEPES,37.65g蔗糖，IgBSA于烧杯中，加入去离子水，用5M的氢氧化钾在30的条件下调节PH至7.1,定容至1L,然后分装于20ml的离心管内，在-20条件下密封储存。需配置的溶液还有：60OmM抗坏血酸钠盐溶液、5mM细胞色素C溶液、50OmMADP溶液、2M谷氨酸钠盐溶液、80OmM苹果酸溶液、2M丙酮酸钠盐溶液、IM琥珀酸钠盐溶液、200mMTMPD溶液、50mM抗霉素A溶液、4M叠氮化钠溶液、80OmM寡霉素溶液、O.ImM鱼藤酮溶液、ImMFCCP溶液、8.1mM洋地黄皂甘溶液。以上溶液除了ADP在-80条件下密封储存外，其余溶液均
13、在-20条件下密封保存901.3 单个核细胞的提取：为了更好的呈现出单个核细胞线粒体呼吸功能，我们筛选并纳入了20例单纯高血压病人和20例健康志愿者，在征求本人同意并签署知情同意书后，静脉穿刺抽取外周血IOmL收集于肝素钠抗凝的试管内,在常温下150OrPm5分钟，祛除血浆,剩余血细胞用HBSS液1:1混匀，将混匀的血标本缓慢叠加入含有2mL淋巴细胞分离液的EP管内，在室温下230OrPm15分钟，细胞分为三层，在上层与中层分解出有一戒指状白色细胞环，为单核细胞层，吸取单核细胞层，加入另一个EP管内，用HBSS液1:1洗涤，2500rpm5分钟离心，祛除上清，底层细胞为单个核细胞。加入3mlM
14、iR05液，充分吹打混匀；取100l混匀的溶液，加入等体积0.4%台盼蓝，在显微镜下进行细胞计数，把细胞数量调整到2*106mi,用于线粒体呼吸功能测定。1.4 线粒体呼吸功能测定方案OXygr叩h-2k高分辨率的呼吸测定仪，它具有两个相同的仓，能在37C的条件下测细胞线粒体的呼吸功能。把已经定量的悬浮在MiR05液抽取加2.1ml于玻璃仓里面，用特定的金属塞封闭玻璃仓。用DatLab5.2进行对数据的分析和处理。为了更精确的测定单个核细胞的线粒体的呼吸功能，利用不同的底物、抑制剂、解偶联剂联合组成了两种不同的方案在把加入悬浮细胞的MiR05液加入玻璃仓并封闭，当呼吸速率平稳以后，我们称这个呼
15、吸速率为基态呼吸（R）,反映细胞正常状态下的有氧代谢活动,随后加入洋地黄皂昔（10g106cells）用来改变细胞膜的通透性，加入苹果酸（M,2mM）、谷氨酸盐（G,5uM）和ADP（D,5mM）可反映复合体I的氧化磷酸化（CIOXPHOs）,然后加入细胞色素C（Cytc,IOuM）检测线粒体呼吸外膜的完整性。最大的氧化磷酸化即复合体I和复合体II的氧化磷酸化（CI+IIopHs,简称P）由琥珀酸盐（SJOmM）后引出。在第一个方案中，随后寡霉素（Omy,2gml）被用于抑制线粒体ATP合酶引出Leak状态（CI+Leak,简称L）,然后逐步加入（1-1.5UM）FCCP反映复合体I和复合体I
16、I非偶联状态下的电子传递能力（CI+IIets,简称E）,随后加入鱼藤酮（Ro30.5UM）抑制复合体I的活性，反映复合体II非偶联状态下的电子传递能力（CnETs,简称E）。在第二个方案中，先加入鱼藤酮（Rot,0.5uM）抑制复合体I的活性，反映复合体的氧化磷酸化（CllOXPHOS），然后逐步加入（1-1.5UM）FCCP反映复合体II的非偶联状态下电子传递能力（CIlEs）o最后，两个方案都加入抗霉素A（Ama,2.5uM）抑制复合体III的活性,待呼吸速率平稳后,加入TMPD（0.5mM）和抗坏血酸盐（As,2mM）,反映复合体IV非偶联状态下电子传递能力（ClVETs）。呼吸控制比（RCR）由CbMIoxPHOS（P）/CHIlLeak（L）得出。1.5 统计学方法统计学处理采用SPSS17.0统计学软件,所有数据用均数土标准误（MeanSEM）表示。两组数据间比较采用双尾
