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1、南方通哥火尊生物化学实验报告姓名：汪煜灵学 号：专业年级：2013级临床医学组 别： 第2实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称肝糖原的提取、鉴定、分离实验日期2014-12-25实验地点 第2实验室合作者陈海玲指导老师朱利娜评分教师签名批改日期一、实验目的1、掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意 事项，掌握其操作方法。3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。4、熟练运用溶液混匀的各种方法。5、正确掌握溶液转移的操作。6、正确操作使用分光光度计二、实验原理肝糖原的提取糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞
2、破碎，低浓度的三氯醋酸 能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于 上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶 于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原的鉴定糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋 中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖， 利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2J2Cu(OH) 2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O2CuOH = H20 +
3、 Cu2O （红色）Cu（OH） 2 = H2O + CuO 1（黑色）肝糖原的定量糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生 物一一5-羟甲基吠喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物 该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10100mg范围内，溶液颜色的深 浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准 溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液 中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分， 而保留肝糖原。三、实验材料仪器：1、普通离心机，室温-100恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，
4、精度为 10mg级电子天平2、剪刀、镊子、研钵3、试管架，离心管，试管4、刻度吸量管（2ml ,5ml），1000 U l微量可调取液器5、100ml容量瓶6、白瓷反应板试剂：鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L（5%）三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、12.5mol/L（50%）NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L） 蒽酮显色剂四、实验步骤肝糖原的提取鸡肝约1.5g，剪碎+5%CCl3COOH 1ml研磨至乳状+5%CCl3COOH 3ml研磨成肝匀浆I全部转入离心管中，离心3min(4000r/min)I取上清液+5ml 95%乙
5、醇，混匀，静置10min离心 5min (4000r/min)I取沉淀+蒸馏水2ml白瓷板中加碘试剂0.1ml加碘试剂0.1ml糖原溶液0.1ml呈色对比沸水浴2min，溶解沉淀糖原溶液1ml+浓 HCl 0.2ml沸水浴加热15min，冷却+50% NaOH 0.2ml糖原水解液0.1ml(2d)糖原水解液| +班氏试剂0.2ml(4d)混匀沸水浴2min，观察变化 注意事项: 1、提取肝糖原时，向上清液中加入等量的95%乙醇后，必须混匀。由于上清液 为水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。加之上清液己4ml多，加上等量乙醇，总量接近9ml,混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅
6、拌混 匀。2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖 残基在20个以下的会使碘呈现红色，20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的 会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基 在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊， 观察不到应有的结果。肝糖原定量测定鸡肝0.15 g| +30% KOH 1.5ml沸水浴15minI冷却，全部转入100ml容量瓶中加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液取3支干净的试管，按下表操作：试剂（ml）空白管标准管样品管蒸馏
7、水1.0标准葡萄糖溶液1.0糖原提取液1.00.2%蒽酮溶液2.52.52.5混匀，沸水浴10min，冷却。在722型或721型分光光度计620nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）.计算：肝糖原（g/100g肝组织）X 0.05 X100肝组织重（g）X 2001000X 1.11五、实验现象与结果讨论糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显变化。糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，但与碘试剂原来颜色区别不大。 鸡肝加碱沸水浴后分层，上层为红棕色，下层无色。加入蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管（由左至右）对比=测定 X 0.05 X 100 X -1 X 1.11A标准肝组织重（g）1000空白管标准管样品管100.6100.085200.6120.085300.6160.091平均值00.6130.087将空白管在620nm处的A值设定为0，测得标准管、样品管的A值如下:肝糖原（g/100g肝组织）F525从肝糖原的定量试验中可知鸡肝样品中含有糖原，但在定性实验中结果不明显，可判断实验 所采用的鸡肝样品含糖原量比较少，造成鸡肝糖原量少的原因可能是用于实验的鸡处于饥饿 状态，糖原分解以维持血糖稳定，因此使肝中剩余的糖原量少于非饥饿状态下的鸡的肝糖原 含量。
