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1、SHANrwlNO IFNIVFRMITY生命科学学院病毒生物学入噬菌体综述摘要：噬菌体是一类温和噬菌体，它们感染大肠杆菌后能进行溶菌性生长(Lytic growth)和溶源性生长 (Lysogenic growth)。其溶源特性对基因重组与遗传工程研究有很大帮助。本文就入噬菌体的基因组结构、溶 源化状态的建立和基因工程应用做简要的综述，分析存在的问题，并对研究方向进行了展望。关键词：入噬菌体溶原性溶菌性基因克隆引言：大肠杆菌噬菌体入为长尾噬菌体科，是一类中等大小的大肠杆菌病毒，其基因组为双链线状DNA，由 48502对碱基组成，分子量3.2x107，约50个基因，特点是相关基因成簇排列，形成
2、若干个操纵子。基因 组两端为粘性末端，中间有相当长的DNA片段是裂解生长非必需的，这就为其作为外源基因的克隆载体提供 了方便。入噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。感染时吸附位点为 细胞壁。属温和性感染；感染的DNA环化并整合于宿主基因组中。以e环双向复制，然后通过滚环机制单向 复制。用于感染大肠杆菌的入噬菌体改造成的载体应用最为广泛。1、The discovery of bacteriophage lambda1951 年 J. Lederberg 的妻子 Esther Lederberg 第一 证明 了 J. Lederberg和Tatum用来杂交的K
3、-12中有原噬菌体，并 命名为入，经10年的研究搞清了溶原化的实质。从此之后，入 噬菌体被广泛用于模式物种；1962年Esther Lederberg的同事并且还是她最好的朋友Allan Campbell首次发现了入DNA整合到细菌DN A的机制； 之后由入噬菌体改造后的载体广泛的用于基因工程。2、The characteristics of bacteriophage lambda2.1、结构特点：入为大肠杆菌温和性噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径 约50nm的二十面体，其内包裹一长线状双链DNA分子（46500bp ），因分子两端各有一含12个核苷酸的 黏性末端，故又可黏合成环状分子。有
4、柔韧的管状长尾，无收缩尾鞘，长约150nm，末端有一根尾丝，蝌蚪 状。病毒毒粒的基本结构是包围着病毒核酸的蛋白质外壳，即壳体（capsid ）或称衣壳。壳体是由大量同一的 壳体蛋白单体分子，即蛋白质亚基（protein subunit）以次级键结合形成的。基于物理学原因和相对简单的 几何学原理，由蛋白质亚基构成的病毒壳体主要取螺旋对称和二十面体对称两种结构形式。如图1，入噬菌体 头部为二十面体对称结构，而柄部为螺旋对称结构。-严Cp5d CollarTail由入噬菌体结构可以看出，其属于复合对称结构，即具有二十面体对称的头部和螺旋对称的柄部。图1:入噬菌体的结构图2入噬菌体电镜照片2.2、基因
5、组特征：A1 制WJI31 Eronl:c I入噬菌体的基因组，为两端不闭合的线型双链DNA，约占粒子重的54%，分子量为30.8x106道尔顿， 48502核苷酸对，长度为17pm ,入DNA分子两末端的5端称为成熟末端，粘性末端由噬菌体颗粒提取的 DNA，其线性分子与两端连接呈环状的分子，可成一平衡状态，但环状分子两条链各有一缺口。在DNA分子 浓聚的情况，分子末端之间连接，可以发生聚集现象。由于DNA两条链的碱基差异，得到的分开的两条单 链，分别称为I和r链（左和右链）。I链的走向是从5f 3的方向，所以是左向或反时针方向转录，5 末端称为m末端，末端碱基为鸟嘌呤（G ）。r链的5f 3
6、走向与I链相反为右向或顺时针方向转录，链 的5末端称为m末端，其末端碱基为腺嘌呤（A）。感染进入菌细胞的入DNA两互补端联结，成为环状 DNA分子，并由宿主细胞的连接酶将两端的缺口封闭成环状DNA分子，噬菌体进行复制、转录和整合。如 在离体的条件下，用DNA聚合酶将此单链的黏性末端补平成双链，DNA就失去其生物活性，不再能有复制 和溶原化的能力。iV2V*吃 远 心 ml Wd cn O F Q SR图3:入噬菌体的DNA线状图谱入基因组可分为四大簇，它们分别是调节区、重组区、复制区和结构基因区（包括与头、尾部合成及组装、 裂解有关的基因）整个基因组如图所示，可分为三个部分，左臂：长约20kb
7、，其中的基因编码构成头部、 尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。中段：长约20kb，是入DNA整合和切出，溶原生长所需的 序列。右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及入DNA复制起始均在这区域内。左右臂包含入DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列； 对溶菌生长来说，中段是非必需的。根据入DNA的环状结构，可将66个可编码的基因分成3个功能区(function block):右边的功能区参与 衣壳形成和DNA的复制，称为右操纵子区；左边的功能区与裂解生长和溶源化功能有关，称为左操纵子 区；中央功能区是入基因组调控操纵子区，
8、也称为免疫操纵子区。ReulstQr of k cl, and mt gene expressiori Regulator ofRegulator、of early genesStabilizer of rtf proteinPhage/recombination 丄 Pfoteins (t Excisionase (for axcieiori From / 7 ehromosome)工招 / /X repressord JrfiPhage DNA ” replication /Ji proteins OReguhtarLysis prafeinsEarly pro movers and op
9、eratorsIntegraseint-(for integration info chromosanneLate gene promoterA TerminaseCutting of DNA at耳i site for packagingA map of phage A, showing rhe major genes.Genes for head proteins and gsemblyGenes for t自it proteins and assemtily图4 :入基因组环状图谱及主要的基因入噬菌体基因组的最大特点是在双链线状DNA两端各有12bp的粘性末端，可以环化，该粘性末端形成的
10、 双链区域称为cos位点(cohensive-end site )。如果将左右臂和中段都去除，仅留下入DNA而端包装噬菌体 所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载 体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用入噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA 能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。图5:通过cos位点，可形成双链环状复制型DNA ( RF DNA )2.3、入噬菌体的侵染过程(1)吸附吸附是病毒表面蛋白与细胞受体特异性的结合，导致病毒附着于细胞表面，这是启动病毒感染的第一阶段。病
11、毒吸附蛋白病毒吸附蛋白(viral attachment protein, VAP )是病毒毒粒表面能够特异性地识别细胞受体并与之结合的 结构蛋白分子，亦称作反受体(antireceptor)。无包膜毒粒的反受体往往是壳体的组成部分，有包膜病毒的 反受体为包膜糖蛋白。编码反受体的基因的突变、能够灭活或破坏反受体的蛋白水解酶、P糖苷酶及中和抗 体等均可导致反受体与受体相互作用能力的丧失，进而影响病毒的感染性。细胞受体病毒的细胞受体亦称病毒受体，是指能被病毒吸附蛋白特异性地识别并与之结合，介导病毒进入细胞，启 动感染发生的一组细胞膜表面分子，其大多数为蛋白质，亦可能是糖蛋白或磷脂。不同种系的细胞具
12、有不同 病毒的细胞受体，病毒受体的细胞种系特异性决定了病毒的宿主范围。病毒的吸附过程病毒毒粒与宿主细胞的初始结合往往涉及一个VAP分子于一个受体蛋白分子的结合，这种结合并不紧密， 是一可逆过程。当毒粒上的多个位点与多个受体结合时就可能发生不可逆的结合，即发生吸附增强作用，这 种增强作用使得毒粒与细胞的结合更加稳定、牢固。病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的 互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性作用及范德华力。(2 )侵入侵入又称病毒的内化，这是一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量的感染步骤。入噬菌体采取注射的方式 将噬菌体核酸注入宿主细胞。(3)脱壳脱壳是病毒侵入后，入噬菌体的壳体
13、除去而释放出病毒基因组的过程，它是病毒基因组进行复制和功能表达所 必需的感染事件。入噬菌体脱壳与侵入是一起发生的，仅有病毒核酸及结合蛋白进入细胞，壳体留在细胞外。(4 )病毒大分子的合成入噬菌体多数情况下进行溶源型感染，因此原噬菌体整合至宿主细胞染色体上，随其进行复制和转录。在这 一过程中多发生的各种病毒复制事件存在着强烈的时序性。病毒复制的时序性主要表现为基因组转录的时间 组织，即病毒基因组的转录是分期进行的。根据病毒大分子合成过程中所发生事件的时间顺序，可以将此过 程划分为3个连续的阶段：病毒早期基因的表达；病毒基因组的复制；病毒晚期基因的表达。入噬菌体DNA合成后腺嘌呤和胞嘧啶被甲基化，
14、或形成由数个单位长度DNA以相同方向连接形成的DNA 复制分子，即多连体(concatemers),以保护入噬菌体DNA免遭宿主细胞核酸酶降解。整合有原噬菌体的宿 主细胞不能够再次接受同源噬菌体的感染。(5 )装配与释放特定情况下，整合于宿主细胞染色体上的原噬菌体会从上面分离下来，表达出入噬菌体必需的结构蛋白以及 多种物质后，装配成为完整的入噬菌体病毒毒粒，进入溶菌阶段，将宿主细胞裂解开而释放出来，再次侵染其 他正常的宿主细胞。3、Lysogenic and lytic process of 入-phage当DNA侵入宿主细胞后。溶原和裂解途径的最初过程是相同的。两者均要求前早期和晚早期基因的
15、表达。 然后发生歧化前早期和晚早期基因表达最终产生CI蛋白，使进入溶原状态，而晚期基因表达使X进入裂解 循环。两个途径不是截然分开的溶原化循环包括3个阶段：溶原的建立、保持和噬菌体的释放第一个阶 段是DNA整合到宿主染色体上。成为前噬菌体状态第二个阶段是阻遏白操纵子的表达。其产物CI蛋白与 CI基因左、右两边操纵子(即早左操纵子和早右操纵子)的操纵基因(OL和OR)结合，抑制它们的转录。阻断 整个溶菌途径。溶原状态得以保持但在紫外线等因素作用下，CI蛋白被钝化，前噬菌体又被切割下来，进 入裂解途径的基因调控程序.图6:入噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式溶菌途径的建立过程按时间顺序可划分为3个阶段，前早期，晚早期和晚期这三个阶段实质是由三个操 纵子，即早左、早右操纵子和晚期操纵子的相继激活，合成了三种重要的调节蛋白，即N蛋白、Cro蛋白和 Q蛋白当溶原化细菌进入溶菌状态时，c I基因即行关闭，CI蛋白不再合成，解除了 CI蛋白对早左、早右 两个操纵子的控制，这就是前早期基因的表达前早期基因表达产物为N蛋白和Cro蛋白.Cro蛋白阻遏CI 蛋白的合成，从而使得以进入裂解循环，而N蛋白使前早期基因的转录越过终止信号而进入晚早期基因，为 溶原和裂解的歧化做好准备.13f主y卯ait ini iis r
