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1、核裂解法大量提取真菌DNA一、试剂的配制1. EDTA-Na2（0.1 M）：称取3.72 g Na2EDTA2H2O，用超纯水定容至100 mL。2. Tris-HCl（1 M，pH）：称取12.11 g Tris-HCl，用90-95 mL超纯水溶解，调pH至8.0后，在定容至100 mL。3. 核裂解液(10 mM Tris-HCl,400 mM NaCl，2 mM EDTA-Na2，0.8 mM 盐酸胍)：分别称取76.43 g盐酸胍，23.38 g NaCl于1 L烧杯中，加入灭菌超纯水充分搅拌溶解至900 mL，再加入10 mL 1 M Tris-HCl和20 mL0.1 M ED
2、TA-Na2，搅拌溶解，调pH至8.0，定容至1000 mL，高温灭菌，冷却待用。4. SDS（20%）：称取20 g SDS，灭菌超纯水定容至 100 mL。（SDS不能采用高温高压灭菌）5. 盐酸胍：强烈变性剂，可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸上解离下来，此外，RNA酶可被盐酸胍等还原剂灭活。二、操作步骤1. 称取液体培养基PPDA培养样品1.0-1.5 g（可用灭菌超纯水或TE缓冲液清洗1-2次），研钵先用液氮预冷，再将样品用液氮研磨，直至全部研磨成均匀粉末。2. 转入预装5 mL(与样品质量比为1:4-1:6 )核裂解液的15 ml离心管中，加入60 l 50
3、 mg/mL蛋白酶K（80-150 l，20 mg/mL），10 l RNase A充分震荡15s混匀。3. 加入500 l 20% SDS（终浓度1%-5%），震荡混匀。4. 56-65水浴，约3 h，至出现较多上清，期间不断颠倒混匀。5. 冷却后，4，6000 rpm，离心10 min，吸取上清至另一新的15 mL离心管中。6. 加入10 l -巯基乙醇（终浓度0.02%），再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒混匀30次左右，6000 rpm，离心10 min。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡）7. 吸取上清至另一新的15 mL离心管，注意不要吸到
4、中间蛋白层。8. 如果上清十分浑浊，可用等体积氯仿/异戊醇（24:1）再抽提一到两次，同样6000 rpm 离心 10 min，将上清转至新的离心管。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡）9. 加入等体积-20预冷的异丙醇（可先加入1/10体积3 M，pH5.2的NaAc，沉淀效果更好），轻柔颠倒混匀，如果DNA沉淀呈絮团状，可用移液枪枪头或干净玻璃棒将DNA絮状沉淀挑出，若DNA不呈完整絮状沉淀或沉淀较少，可在-20 冰箱放置1-2 h促沉淀。10. 若DNA沉淀无法直接挑出，可4，6000 rpm，10 min收集沉淀，弃尽上清，挑出DNA沉淀。11. 将DNA沉淀转入
5、2 mL EP管，加入1 mL预冷的70%乙醇，轻弹管壁重悬沉淀。混匀洗涤2-3次，以去除残余的盐，12000 rpm，2 min弃尽上清。12. 加入1mL预冷的无水乙醇，轻弹管壁重悬沉淀；12000 rpm，离心2 min。（动作轻柔，不可剧烈震荡，避免造成DNA断裂）13. 室温放置10-15 min左右，使乙醇完全挥发，加入适当体积的灭菌超纯水或TE缓冲液溶解。CTAB法大量提取真菌基因组DNA一、试剂的配制1. CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）提取液（PH 8.0）：2% CTAB（w/v），1.4 M Nacl，0.02 M EDTA，0.1 M Tris-cl，0.2%巯基乙醇
6、。即称取CTAB 2 g加蒸馏水40 ml，加1M Tris-cl（PH8.0）10 ml，0.5 M EDTA（PH 8.0）4 ml和5 M NaCl 28 ml（约8.19 g NaCl），于65下溶解，用蒸馏水定容到100 ml，最后pH值8.0，灭菌后加入0.2 ml -巯基乙醇。2. 1 M Tris-cl（PH 8.0）：12.11 g Tris碱；ddH2O，80 ml；HCl，4.9 ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0，定容至100 ml。3. 0.5 M EDTA（PH 8.0）：在80ml水中加入18.01 g EDTANa22H2O搅拌溶解，用NaOH调P
7、H至8.0（约2 g NaOH颗粒），定容至100 ml。4. 5 M NaCl 100ml：称取29.22 g NaCl ，用ddH2O定容到100 ml。5. 3 M NaAc 10ml：称取2.46 g NaAc，用ddH2O定容到10 ml，pH5.2。6. TE溶液： Tris-HCl（pH=8.0，1 mol/ L ）5 ml，EDTA（pH=8.0，0.5 mol/ L）1 ml，加ddH2O定容到500 ml，PH8.0。二、操作步骤1. 称取液体培养基PPDA培养样品1.0 g，研钵先用液氮预冷，再将样品用液氮研磨均匀，直至全部研磨至粉末，转入15 ml离心管中，加入4 mL
8、(与样品质量比为1:4-1:6 )65预热的CTAB溶液（用前加入0.2%的-巯基乙醇），充分振荡混匀。2. 65水浴，约45 min-60 min，期间颠倒混匀3-4次。3. 冷却后，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀30次左右，12000 rpm，离心15 min。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡）4. 吸取上清至另一新的15 mL离心管，注意不要洗到中间蛋白层。5. 加入等体积氯仿:异戊醇（24:1），12000 rpm，离心15-20 min，若上清仍十分浑浊，可重复2-3次。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡）6.
9、吸取上清，转入新的离心管中，加入1/10体积的NaAc（3 M，pH5.2）。7. 加入等体积-20预冷的异丙醇或两倍体积的无水乙醇颠倒混匀后置于-20冰箱放置 1-2 h。（颠倒混匀动作轻柔，不可剧烈震荡，避免造成DNA断裂）8. 12000 rpm，10 min弃上清。9. 向离心管中加入70%的乙醇至管中2/3体积，混匀洗涤2-3次，以去除残余的盐，12000 rpm，2 min弃尽上清。10. 室温放置10-15 min左右，使乙醇完全挥发，加入适当体积ddH2O或TE缓冲液溶解，同时加入2-10 l RNA酶A，混匀，37水浴30-60 min。准备药品：Tirs碱、浓盐酸、EDTA
10、Na22H2O、NaOH、NaCl、CTAB、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、NaAc、液氮、巯基乙醇研钵、恒温水浴、离心机、离心管三、基本原理样品在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁，游离出细胞器和原生质，并防止DNA降解。采用CTAB（十六烷基三甲基溴化胺，一种非离子型去污剂）抽提液抽提（65）上述研磨物。在低离子强度溶液中CTAB具有沉淀核酸与酸性多聚糖的特性，在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB溶解细胞膜相物质，与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后经过多次乙醇漂洗和沉淀，用RNase水解RNA， TE缓冲液或已灭菌
11、超纯水溶解得到较为纯净的DNA粗提物Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除基因组DNA。蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；多糖的去除：高盐法，用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。
12、用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化；多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合； 盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附，沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%
13、的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase，pH值为8.0，可防止DNA发生酸解。DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应，DNA中残留有金属离子，有RNA的存留。对策：重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀DNA，让酒精充分挥发，增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)，加入RNase降解RNA。四、DNA质量检测1. 取2-5 l DNA，加1l 6上样缓冲液混匀，以HindIII DNA marker作为分子量标准，在1TAE缓冲液中于120 V进行琼脂糖凝胶
14、电泳20-30 min，于紫外成像仪中拍照，检查DNA的质量；2. 取待测DNA样品10 l至一洁净的离心管中，加蒸馏水稀释至2 mL，转入到洁净的石英比色皿中，以等体积蒸馏水作为空白对照，于快速核酸蛋白分析仪或分光光度计上测定OD260及OD280，根据OD260计算DNA的浓度，并以OD260/OD280的大小确定DNA的质量；五、常见问题1. 用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？有什么优点？苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：有效
15、变性蛋白质；抑制了DNase的降解作用。缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。不能完全抑制RNase的活性。2. 氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿异丙醇抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）3. 用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。4. 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在
16、溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。5. DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。DNA提取常见问题：材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断，外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融，液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。6. DNA
