酶活性及酪氨酸酶

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1、酶催化活性及其影响因素的研究学院:化学与分子工程学院班级:应用化学108班 姓名:王文移05 宁家彬06酶催化活性及影响其活性因素的研究作者：王文移宁家彬摘要:酶广泛存在与生物体中，对生命的生化反应至关重要，本实验主要探 究不同浓度下催化活性的不同，以及温度，pH值，抑制剂对于酶活性的影响。关键词:酪氨酸酶，唾液淀粉酶，活性，pH，温度，抑制剂Enzyme is widespread and in living organisms, biochemical reactions vital to life, this experiment mainly explore different cat

2、alytic activity of different concentrations, as well as temperature, pH value, effect of inhibitor for the enzyme activity.引言认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中在酶存在下的合成或 分解与普通的有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性， 是当今对酶的研究不可或缺的话题。通过本次实验能够掌握生物活性物质的提 取和保存方法，学会使用仪器分析手段研究催化反应特别是生物化学体系中催 化过程的基本思想和方法。酪氨酸酶是一种氧化还原酶，它广泛存在于动植物和微生

3、物中。土豆的提取 液中含有酪氨酸酶。人唾液中的淀粉酶为a-淀粉酶，在唾液腺细胞内合成。酶 的活性会受到很多因素的影响，如温度、PH值、底物浓度以及激活剂抑制剂的 影响。本实验目的在于测定各个因素对于酶活性的影响。1. 实验原理本实验采用唾液淀粉酶及酪氨酸酶来进行反应，主要观察淀粉与试剂的反应颜 色，多巴的吸光度。本实验从土豆中提取酪氨酸酶，并测定其催化活性。当土豆、苹果、香焦等的 受损面接触空气后会产生深棕色的现象是人们都见过的，这是这类物质含有酪 氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当暴露在空气中后，在氧气的参与下， 会发生一系列反应。以下是主要的反应过程。由于多巴转变成多巴红的反应速率较快，

4、再转到下一步产物速率则慢得多，故 可选择多巴转变为多巴红的反应速率的测定来判断催化反应的活性。因多巴红 具有特殊的颜色，故可用分光光度法测定，在不同的时刻测定某特定波长下的 吸光度，用吸光度对时间作图，从所得的直线斜率求酶的活性。酶的活性计算方法：一般定义在优化的条件下（包括pH值、离子强度、温度 等），25C时在1min内转化1 mol底物所需要催化剂的量为活性单位。通过KA下式可计算酶的活性：a =x 106，式中，a为所用溶液的酶的活性，AA为ktV最大吸收波长吸光度的变化，t为时间（min）, k为多巴红的摩尔吸收系数，V 为加入酶的体积，进而计算出原料（土豆）中酶的活性：A aVo/

5、m。式中A 为原料中酶的活性（注意此处A不是吸光度A），V为原料所得的酶溶液的总 体积，m为原料总质量。淀粉在淀粉酶作用下发生分解，其变化为：淀粉一一紫色糊精一一红色糊精一 一麦芽糖，葡萄糖。淀粉与糊精无还原性，对班氏试剂呈阴性；麦芽糖与葡萄糖则是还原性的糖， 与班氏试剂共热生成红棕色氧化亚铜的沉淀。反应最适温度为37-4oC，最适pH为6.8, Cl-离子是激活剂，Cu2+离子是抑制 剂。下图为多巴在酪氨酸酶的催化作用的下的反应历程黑包素2. 实验仪器与试剂1、仪器：分光光度计、离心机、研钵、水浴、秒表2、试剂：二羟基苯丙胺酸（多巴）、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸、土豆、淀 粉溶液，碘液、班氏

6、试剂、盐酸、乳酸、碳酸钠、氯化钠、硫酸铜3. 实验步骤3.1酪氨酸酶的活性研究3.1.1. 溶液配制0.10mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.2）： 50ml 0.20mol/L 磷酸二氢钠+8ml 0.1mol/L盐酸，定容至200ml；0.10mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=6.0）： 50ml 0.20mol/L 磷酸二氢钠+22ml0.1mol/L盐酸，定容至200ml；0.10mol/L多巴溶液：0.195g多巴，用pH=6.0的磷酸缓冲溶液定容至100ml （现用现配）。3.1.2酶的提取取新鲜土豆，清洁后切碎，称取10.0g置于研钵中，加入7.5mL pH=7.2的磷酸 缓冲溶

7、液，用力挤压，两层纱布滤出提取液，立即离心分离（3000rpm， 5min），倾出上层清液保存于冰浴中，提取液为棕色，在放置过程中不断变 黑。3.1.3酶的活性测量取2.5ml上述提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释到10ml比色管中，摇匀分别取0.1mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入2.5mL pH=6.0的缓冲溶 液，再加入2ml多巴溶液，同时开始计时，用分光光度计在480nm处测定吸光 度。开始6min内每分钟读一个数，以后隔2min读一个数，直至吸光度变化不 大为止。取0.2ml，0.3ml。0.4ml已稀释过提取液重复上述实验（总体积为5ml）。以吸光度对时间作图，从直线斜率求

8、出酶的活性。3.2淀粉酶的活性研究3.2.1. 淀粉酶活性的检测：取一只试管加入5ml淀粉溶液和0.2-2ml唾液，混 匀后水浴（37（）在白瓷板上用碘液观察颜色，至微黄色为止，向上述试管中 加入2ml班氏试剂，放入沸水中加热十分钟观察实验现象3.2.2. pH对酶活性的影响：取四只试管分别加入盐酸，乳酸，蒸馏水，碳酸钠 各2ml再加入2ml淀粉溶液和2ml酶溶液，37度水浴，5分钟后加入2ml班氏 试剂，沸水浴，观察沉淀生成情况3.2.3. 温度对酶的影响：三只试管分别加入3ml淀粉，另外三只加1ml淀粉 酶，分别成组在0，37，70度下水浴，5分钟后混合，5分钟后加碘液，观察颜 色3.2.

9、4.抑制剂与激活剂的作用管号123NaCl/ml1-CuSO /ml 4-1-蒸馏水/ml-1淀粉酶溶液/ml111淀粉溶液/ml333滴加碘液，观察溶液颜色变化3.3影响酶活性的因素的研究（1）取0.40ml稀释过了的提取液在沸水浴中加热5min，冷却后配成测定溶 液，观察现象。（2）取0.40ml稀释过的提取液，加入少量的固体NaS O配成测定溶液，观2 2 3察现象。（3）取0.40ml稀释过的提取液，加少量EDTA振动混合，反应一段时间后配 成测定溶液，观察现象。4. 实验数据记录及讨论（一）酪氨酸酶催化活性研究加入不同量的酶在不同时间反应的吸光度如下表（表1）所示，由于反应 在8分钟

10、以后已经趋于平缓，故在12分钟以后的两组（14、16）实验数据未列 出。表1：不同酶加入量不同时间反应的吸光度测定提取 液/mL不同反应时间/（min）吸光度测定值123456810120.100.0810.0930.1000.1130.1270.1400.1370.1380.1410.200.1390.1520.1670.1830.1980.2210.2260.2300.2300.300.1870.2010.2230.2400.2560.2710.2810.2830.2900.400.0150.0190.0260.0330.0370.0450.0440.0510.058以吸光度值为纵坐标，时

11、间为横坐标，可得出在加入酶的作用下多巴的转 换动力学过程，再由直线部分得出转换速率，即为酶的活性。为使作图更为准 确，现只取前六分钟内数据作图如下：图1:0.10mol提取液关系曲线图2:0.20mol提取液关系曲线图3:0.30mol提取液关系曲线 曲线依次得出不同提取液的活性，比较不同体积的提取液加入后相同量的多巴 转换速率。由于放置时间较长，第四组实验已经失去可靠性。(酪氨酸酶的吸 光系数为lg k=3.7。)表2：酶的活性计算已稀释的提取液体 积/mL活性/Amin-1原提取液活性/ (mL-1)原料活性/ g-10.l00.01121.9417.550.200.01615.9612.

12、770.300.01711.319.0480.400.0062.9932.394（1）在沸水浴中加热5分钟冷却后测得的溶液吸光度基本保持不变，其酶的活 性在高温下失活。（2） 且比 性。加入少量固体Na2S2O3配成的测定溶液，其测得的吸光度也基本保持不变（1）条件下的吸光度还小，其原因是硫代硫酸钠是还原剂，使蛋白质变稀释的提取液加入少量EDTA振动混合，其测得的吸光度在缓慢减小。其（3）原因是EDTA与辅助因子络合，使酶活性失活。5. 实验结果讨论根据酪氨酸酶的活性实验得出结果，可知活性本应当随着酶浓度的增大而 增大，但在实际实验中却出现活性随酶浓度的增大而先增大后减小的情况出 现，可能是因

13、为在酶提取之后未保存在冰浴中导致没失活，从而导致酶活性的 变化出现异常情况。关于酶的活性影响因素的实验可得出以下结论（1） pH对活性影响：1. pH过小（过酸）、过大（过碱）都能使酶蛋白变性而失活.2. pH的改变能影响酶活性中心上必须基团的解离程度，同时也可以影响底物和 辅酶的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化，只有在特定的pH 下，酶、底物和辅酶的解离状态，最适宜它们相互结合，并发生催化作用，从 而使酶反应速度达到最大值。这个pH称为酶的最适pH。唾液淀粉酶的最适PH 为中性，故在蒸馏水中沉淀最多，盐酸酸性过强，使酶的活性失活，乳酸是弱 酸，颜色基本不变，碳酸钠是弱碱，产生较

14、少的沉淀。（2）温度对酶活性的影响：酶的催化作用受温度的影响很大，酶的化学本质是蛋白质，所以温度过高会引 起蛋白质变性导致酶的失活，唾液淀粉酶在70。和0时，酶活性失活，颜色 呈蓝色。在37时，是唾液淀粉酶的最适温度，淀粉遇唾液淀粉酶水解，颜色 呈浅黄色。（3）抑制剂与激活剂对酶活性的影响：酶的活性受某些物质的影响，能使酶活性增加的称为激活剂，能使酶活性降低 的称为抑制剂。很多少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特 异性。本实验中氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。所以加入 NaCl后，溶液颜色为浅黄色。氯离子促进唾液淀粉酶的水解。铜离子作为抑制 剂，故加入硫酸铜后，溶液

15、颜色为深蓝色。水作为对照变量，加入后对溶液稀 释，颜色为浅蓝色。参考文献1 KenllnerR,MermetJM,OttoMWindmerHM.AnalyticalChemistry.Chapter6.Weiheim:Wiley VCH , 1998 ;北京大学、吉林大学合译.分析化学.北京:北京大学出版社，2000 .第6章2 王希成编.生物化学（第3版）.北京：清华大学出版社2010 .第4章3 StryerL编，唐有棋等译.生物化学.北京：北京大学出版社，19904 Frieclman M E,DaronHH.JchemEdu , 1977 , （54） : 2565 叶率官.化学试剂，1981 , （2） ; 6