酶的定向进化方法

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1、摘要酶的体外定向进化是蛋白质工程的新策略 . 不需事先了解酶的空间结构 和催化机制 ,而是通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结 合确定进化 方向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非 天然酶 .短期内 可以在试管中完成自然界需要几百万年的进化过程，因此可能是发现新型酶 和新的生理生化反应的重要途径 .关键词蛋白质工程 模拟定向进化理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发， 这是酶的体外定向进化的基本先决条件 .所谓酶的体外定向进化 ( directed evolution of enzyme in vitro), 又称实验分子进化( experimentally

2、 molecular evolution), 属于蛋白质的非合理设计( irrational design )，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制 1，通过人 为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在 体外改造酶基因 , 并定向选择出所需性质的突变酶 . 酶的体外定向进化技术 极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所 不能解决的问题， 为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工 业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力 .1定向进化的原理在待进化酶基因的PCRT增反应中，利用Taq DNA多聚酶不具有3 5校对功能的性质，配合适当条件，

3、以很低的比率向目的基因中随机引入突 变 , 构建突变库 , 凭借定向的选择方法 ,选出所需性质的优 化酶(或蛋白质), 从而排除其他突变体 . 定向进化的基本规则是 , “获取你所筛选的突变体” 2. 简言之 ,定向进化 =随机突变 +选择.与自然进化不同 ,前者是人为引 发的 ,后者虽相当于环境 ,但只作用于突变后 的分子群 , 起着选择某方向 的进化而排除其他方向突变的作用，整个 进化过程完全是在人为控制下进行 的.2随机突变的策略2.1 易错 PCR易错PCR(error-prone PCR34是指在扩增目的基因的同时引入 碱基错配 , 导致目的基因随机突变 . 然而，经一次突变的基因很

4、难获得 满意的结 果，由此发展出连续易错 PCR(sequential error-prone PCR) 策略.即将一次 PCRT增得到的有用突变基因作为下一次PCFT增的模板,连续反复地进行 随机诱变 , 使每一次获得的小突变累积而产生重要 的有益突变 . Chen 等人 5，6用此策略使在非水相(二甲基甲酰铵 , DMF) 溶液中定向进化枯草杆菌蛋 白酶E的活性获得成功，所得突变体PC3在60唏口 85%勺DMF中,催化效 率k/匕分别是野生酶的256和131倍,比活性提高了 157倍将PC3再进 行两个循环的定向进化2，产生的突变体13M的kcat/Km比PC3高3倍(在 60%DM中)

5、，比野生酶高471倍.在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部 , 故属于无性进化 (asexual evolution ). 它较为费力、耗时，一般适用于较小的基因片 段(800 bp). 此外, 使用该方法易出现同型碱基转换 .2.2 DNA改组和外显子改组 7， 8DNA 改组(DNA shuffling )又称有性 PCR(sexual PCR)，原理 如图1 所示. 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的 机会, 导致 更大的变异 , 最终获取最佳突变组合的酶 . 在理论和实践 上, 它都优于“重复 寡核苷酸引导的诱变”和“连续易错PCR”. 通过DNA改组，不仅可加速积

6、累有益突变9，而且可使酶的2个或更多的已优化 性质合为一体心15.外显子改组(exon shuffling )严17类似于DNA改组，两者都是在 各自 含突变的片段间进行交换， 前者尤其适用于真核生物 . 在自然界中 , 不同分 子的内含子间发生同源重组 , 导致不同外显子的结合 , 是产生新 蛋白质的有 效途径之一与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源 性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上外显子改组可 用于获得各种大小的随机肽库 .2.3 杂合酶杂合酶(hybrid enzym181是把来自不同酶分子中的结构单元(二 级结 构、三级结构、功能域)或整个酶分

7、子进行组合或交换 ,以产生具 有所需性质 的优化酶杂合体有许多途径可以产生杂合酶，如定位诱变、DNA改组、 不同分子间交换功能域，甚至整个分子融合.杂合酶可用于 改变酶学或非酶学 性质 , 是了解酶的结构 - 功能关系、以及相关酶的结构 特征的有力工具，不 仅如此，它还可以扩大天然酶的潜在应用，甚至可 以产生催化自然界不存在 的反应的新酶分子 . 杂合酶方法的有效性和实 用性已得到了实验的证实19 251.2.4 体外随机引发重组体外随机引发重组( random|priming %in vitro%recomb in atio n, RPR：的以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先 产生

8、大量互补于模板不同位点的短 DNA 片段，由于碱基的错配和错误引 发, 这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCF反应中，它们互为 引物进行合成 , 伴随组合 , 再组装成完整的基因长度 . 如果需 要, 可反复进行 上述过程 , 直到获得满意的进化酶性质（图 2）. 该法优 于 DNA 改组法的特 点在于：（1） RPR可以利用单链DNA为模板，故可10 20倍地降低亲本 DNA量；（2）在DNA改组中，片段重新组装前必 须彻底除去DNase I，故 RPF方法更简单；（3）合成的随机引物具有同样长度,无顺序倾向性在理 论上， PCFT 增时模板上每个碱基都应 被复制或以相似的频率

9、发生突变；（4）随机引发的DNA合成不受DNA模板长度的限制2.5 交错延伸交错延伸（ stagger extension process, StEP） 27原理的核心是 , 在 PCF 反应中把常规的退火和延伸合并为一步,并大大缩短其反应时间 （55 C, 5 s）,从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内 同时存在的不同模板退火而继续延伸 . 此过程反复进行 , 直到产生完整的基因 长度 , 结果产生间隔的含不同模板序列的新生 DNA 分子 （ 图 3） .StEP法重组发生在单一试管中，不需分离亲本DNA和产生的重组DNA. 它采用的是变换模板机制 , 这正是逆转录

10、病毒所采用的进化过程 28. 该法简便且有效 , 为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具 .2.6 酶法体外随机 - 定位诱变为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题 , 我们曾以类胰岛素样人 参多 肽基因和天冬氨酸酶基因为模型 , 探索了一种酶体外诱变的新途 径, 即酶法体 外随机 - 定位诱变 （random-site- directed mutagenesis） 29 32 . 该方法的内 涵与酶的体外定向进化类 似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点 , 以快 速产生优质酶 , 又 让其突变受到一定限制 , 以减少筛选突变体的工作量 . 实 际上,该法也是体外模拟自然进化不同点在于，

11、通过控制DNA合成的底物 种类和浓 度比例实现碱基对的错配 .从上述策略不难看出 , 随着分子生物学技术的发展 , 可以更灵活、快 速 和简便地改造目的基因 . 从功能出发 , 先获得某优化的突变体 , 一方 面可快 速将其推向应用 , 另一方面将对蛋白质的理论 研究起到更大的推 动作用 .图1 DNA改组原理图 2 体外随机引发重组原理图 3 交错延伸原理3 定向进化的选择策略尽管用上述方法可向人类提供新的有价值酶 , 但酶的功能突变常常 被埋 没在众多的中性突变和不利突变群中 . 采用回交（ back-crossing ） 法，将 已进化的子代突变酶基因与野生酶基因重组33, 可排除这种干

12、扰. 这样 ,出现中性突变的频率只是 50%,可全部去除不利突变 . 在 定向进化中 ,尽管突变具有随机性 ,但通过选择特定方向的突变限定了 进化 趋势 ,加之控制实验条件 ,限定突变种类 , 降低突变率 ,缩小突变 库的容 量，这不仅减少了工作量 , 更重要的是加快了酶在某一方向的进 化速度.通常，筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关34 35Venekei等 人 36报道了快速、有效地筛选蛋白水解酶突变体的方法和最佳筛选条件,主要是利用蛋白酶选择平板初选 , 再配合活性染色（ activity staining ）和 X- 光片消化分析（ X-ray film digestion assa

13、y ）加以验 证,并检测其活力 ,快 速筛选了 44 000 个突变株.Roberts等人用嗜菌体表面呈现技术筛选与嗜中性酯酶结合力更强 的抑制剂 . 从含有 4 900 个突变体的基因库中，获得与该酶的结合能 力高于 野生蛋白质3.6 x 106倍的突变体，比已报道的任何一个相应的抑制剂高50 倍38 .另有一些其他的筛选方法 39， 40 , 如加入能产生可见光信号的底物 17或 利用绿色荧光蛋白的荧光性质41等.总之,选择在酶的体外定向进化中至关重要 , 直接关系到其成败 .4 定向进化的优势、现状和未来较之蛋白质分子的合理设计 , 酶的体外定向进化属于非合理设计 （irrational

14、design ）. 其突出的优点是 , 不需事先了解酶的空间结构和催化机制 . 它适宜于任何蛋白质分子 , 大大地拓宽了蛋白质工程学的 研究 和应用范围.特别是它能够解决合理设计所不能解决的问题114244，使我们能较快、较多地了解蛋白质结构与功能之间的关系，为指导 应用 （如药物设计等）奠定理论基础 . 此外 , 该技术简便、快速、耗资低 且有实 效 . 总之, 酶的体外定向进化是非常有效的更接近于自然进化的 蛋白质工程 研究的新策略 . 它不仅能使酶进化出非天然特性 , 还能定向 进化某一代谢途 径 ; 不仅能进化出具有单一优良特性的酶 , 还可能使已 分别优化的酶的两个 或多个特性叠加

15、, 产生具有多项优化功能的酶，进 而发展和丰富酶类资源 ; 完全在试管中进行的酶（或蛋白质）的体外定 向进化使在自然界需要几百万 年的进化过程缩短至几年10，这无疑是蛋白质工程技术发展的一大飞跃 . 目前，对一些酶（或蛋白质）（表 1）、 砷酸盐解毒途径 45、抗辐射性 46、生物合成途径 47、对映体选择性 48、 抗体库49以及 DNA 吉合位点定向进化5的可喜成果令众多的相关科 学 家为之振奋 . 可见 , 进化能发生在自然界 , 也能发生在试管中，它与合 理 设计互补 , 将会使分子生物学家更加得心应手地设计和剪裁酶（或蛋 白质）分子， 将使蛋白质工程学更加显示出强大的威力和诱人的前景表 1 酶的体外定向进化应用实例酶性质突变方法参考文献n枯草杆菌蛋白酶E有机相活性生/稳定性易错PCR2, 26,B -内酰胺酶总活力/底物专性DNA改组27了J枯草杆菌蛋白酶BPN稳定性盒