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1、下面内容综合了 Agilent和网上查到的一些资料：一般来说，反相HPLC的流动相包括有机相和水相，有机相常用的为色 谱甲醇和乙腈，不太常用的还有四氢吠喃和异丙醇。甲醇有其性价比的优势，但 是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫外吸收，会 降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇大，但是洗脱能力比甲 醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统压力要比甲醇低很多，且截止波长 比甲醇低20nm，增加了检测出在低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们 一般倾向于多用乙腈，少用甲醇。但是当样品峰形不好或者分离不好时，更换溶 剂是一个很好的选择，因为不同的溶剂可提供不同的选
2、择性。在反相色谱中，流动相中水相的pH和离子强度在开发对条件微小变化 不敏感的耐用方法中非常重要。对于离子型化合物，典型样品的保留随pH改变 而明显变化，因此控制pH对于保留和选择性的稳定非常重要，通常在pH24的 条件下，保留时间对pH的微小改变稳定性最高，因此建议将这一 pH范围作为大 多数样品方法开发的起始pH，包括碱性化合物和一般的弱酸。考虑到重现性， 所用的pH应高于或低于待分析物pKa或pKb上下一个pH单位。当待分析物pKa 或pKb未知时，应测试一种以上流动相pH (如和缓冲盐溶液)，可提供最好结果。对流动相的优化主要体现在水相上。流动相pH值对色谱分离的影响有多钟 方式，根据
3、待分析物的结构性质，pH可能影响选择性、峰形和保留。如果是非 极性较强或中性的化合物，pH对分离度和保留的影响一般不明显。如果是可离 子化的化合物，如酸或碱，保留因子和选择性随pH改变非常明显。(1) 酸性分析物，应选择低pH缓冲液流动相，以防止分析物离子化。 了解分析物的pKa，才能有效的选择流动相pH。缓冲范围应在其缓冲液离子pK 值1 pH单位，使流动相的优化具有一定的灵活性。例如，醋酸盐的pKa为， 缓冲范围为。(2) 碱性化合物，在高pH条件下才能得到其非离子形态，但这对色谱 柱不利。通常许多碱性化合物在低pH条件的保留就已经满足要求了，所以可选 择低pH条件。如果选择高pH条件，则
4、注意需选择耐强碱的色谱柱。水里可以加酸、加碱、加盐，从而改变pH值、改善峰形、提高分离度。 常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。单纯做液相时， 低波长下磷酸最合适；而做液质时首选三氟乙酸，或甲酸、乙酸。开发液相分析 方法时流动相可首选的磷酸水溶液，然后再以此为基础做优化。在单独用酸不 行的时候再考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是：简单、稳定、缓冲能力强、 配制简单，需要调pH值时要有相应的酸或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是 钾盐和钠盐，还有醋酸盐，常用的盐浓度在1020mM左右(根据实际情况，有时 可以选择更低或更高浓度，建议最高浓度不超过50mM)。下表是Waters
5、提供的一个资料，常规实验室建议使用的缓冲盐体系。缓冲盐/流pKa缓冲范 围发挥否MS是兼备注动相改 性剂性(1pH)容TFA-旦旦是是离子对试剂，能够抑 制MS信号，通常使用的 浓度范围%乙酸-旦旦是是同乙酸铵一起使用 具有最大的缓冲能力，通 常使用的浓度范围%甲酸-旦旦是是同甲酸铵一起使用 具有最大的缓冲能力，通 常使用的浓度范围%乙酸盐（铵盐）旦旦是是通常使用110mM浓 度，注意钾盐和钠盐是非 挥发性的甲酸盐（铵盐）旦旦是是通常使用110mM浓 度，注意钾盐和钠盐是非 挥发性的磷 酸盐1否否传统的低pH缓冲体 系，UV透光度很好磷酸盐2否否当pH超过7时，降 低操作温度/缓冲盐浓度 以及
6、使用保护柱可以延 长色谱柱寿命磷酸盐3否否当pH超过8时，降 低操作温度/缓冲盐浓度是是是是否否否4- 甲基吗 啡啉氨水碳 酸氢铵(HCO3-)(NH4+)乙酸铵甲 酸铵硼 酸CAPSO （3- 环己胺 基-2-羟 基丙磺 酸Gly cine 甘 氨酸,以及使用保护柱可以延 长色谱柱寿命口 通常使用浓度为 是.10mM或更少通常使用浓度为510mM （用于MS工作时曰 保持离子源温度超过是150C）。用氨水或乙酸 调节pH值，在pH10时具 有很好的缓冲能力。曰通常使用浓度为正 110mM曰通常使用浓度为正 110mM降低温度，减少浓度 否并使用色谱柱来延长柱 寿命两性离子缓冲液，同 否乙腈互溶，通常使用浓度 为110mM，气味小两性离子缓冲液，比否使用硼酸盐对柱子的损伤更小些1- 甲基哌 啶旦旦是是通常使用浓度为 110mMCAPS否否两性离子缓冲液，同 乙腈互溶，通常使用浓度 为110mM，气味小乙胺（乙 酸盐）旦旦是是通常使用浓度为%。 当使用乙酸滴定时形成 可挥发性的缓冲液（不可 用盐酸或磷酸）。作为离 子对试剂用于pH79条件 下的DNA分析毗 咯烷旦旦是是温和的高pH缓冲液 体现，柱寿命较长
