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1、XXX 化 工 医 药 职 业 技 术 学院毕 业 论 文青霉素酰化酶制6-APA学生姓名 班 级 煤化 专业名称 应用化工(煤化工方向)系部名称 化学与环境工程系 指导教师 提交日期 2011年1月4日 化 学 与 环 境 工 程 系 摘要6氨基青霉烷酸(6-APA)是重要的抗生素药物中间体之一，目前均采用青霉素酰化酶酶促裂解青霉素获得。本文介绍近年来青霉素酰化酶催化青霉素水解的研究进展，青霉素酰化酶的性质及其催化机理，青霉素酰化酶的固定化方法，青霉素酰化酶反应器的设计，反应介质工程的研究进展。 青霉素酰化酶(penicillin acylase，penicillin amidase，pen
2、icillin， ami dohydralse，EC 3.5.1.11)可以裂解青霉素获得重要的医药原料6氨基青霉烷(6-APA)。在自然界中来源广泛，细菌、放线菌、酵母和高等真菌都可以产生青霉素酰化酶。尽管有报道推测青霉素酰化酶是在代谢芳香族化合物作为碳源的过程中具有一定的作用，但产生的机理仍未明确。随着工业化进程的发展，环境污染的加重，生物催化绿色浪潮随之兴起，青霉素酰化酶的应用越来越广泛，围绕着青霉素酰化酶酶促裂解青霉素制备6-APA的研究也备受关注，作为一种重要的工业酶，青霉素酰化酶在制备6-APA中的应用已经有近三十年的历史了。本文对这一方向近年来的发展做一综述。 目录第一章 酶的性
3、质及其催化机理1第二章 青霉素酰化酶的固定化3第三章 青霉素酰化酶催化生产6-APA5 第一节 两相系统中裂解青霉素的研究5 第二节 离子液体系统中裂解青霉素的研究7 第三节 反应器及其他技术7第四章 结语9参考文献10致谢11第一章 酶的性质及其催化机理根据青霉素酰化酶在催化水解反应时所偏爱的底物不同，可将青霉素酰化酶分为3类：青霉素G酰化酶、青霉素V酰化酶和氨苄西林酰化酶。近年来的研究发现，自然界仍然存在其它种类的青霉素酰化酶，如从放线菌中分离到的青霉素酰化酶可以水解一些天然脂肪族的青霉素，因此可以定义为青霉素K酰化酶。青霉素酰化酶催化水解的底物结构非常相近，但是青霉素酰化酶的结构上差别较
4、大。来源于大肠埃希菌(Escherichia coli)的青霉素G酰化酶具有一个20.3ku的亚基和一个68.4ku的亚基。来源于球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)的青霉素V酰化酶是四个34.7ku亚基组成的四聚体。这两类酶都是N末端亲核水解酶的大家族成员，N末端亲核水解酶的共同点是在N末端具有催化残基。虽然青霉素V酰化酶的亲核残基是丝氨酸，青霉素G酰化酶的亲核残基是半胱氨酸，但是它们的折叠却是惊人的相似，都具有一个四层的催化活核心结构 。通过对来源于大肠埃希菌的青霉素G酰化酶的研究发现，它具有唯一活性中心，两个亚基紧密交织在一起，组装成肾脏形，中间有一凹槽，杂-二聚体的大
5、小表示为7nm5nm5.5nm。两者之间没有明显的分离区域，亚基之间接触角痕大，20%为疏水氨基酸，酶与苯乙酸、苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的结合部位位于底物侧链的结合部位。这些抑制剂的苯基部位直接伸到酶分子疏水袋。Met142，Phe146，Phe57，Trp154，Ile177位于疏水袋两侧，Ser67封住疏水袋的底部袋口，由Ser1和Asn241的侧链和23，69的主链氮原子组成。McVey等采用多底物竞争性抑制，用X晶体衍射测定了底物苯乙酸、3，4二羟基苯乙酸、2，5二羟基苯乙酸、p硝基苯乙酸等与青霉素酰化酶形成的复合物的三维结构，这些复合物结构揭示了底物结合区域构象的变化可能作为酶自
6、催化的开关。结果发现Arg 263参与了与底物的结合并协助Asn 241的定位，Phe 146是底物进入活性中心的开关，酶活性高度依赖于Asn 241，在催化中心部位，241 Asn会导致形成氧阳离子的洞，而且对底物与Ser 1也起到定位的作用，所以准确地说，青霉素酰化酶的催化活性中心是SerAsn二联体。青霉素酰化酶的水解青霉素G的机制是1995年由Duggleby等阐明，青霉素酰化酶主要由其亚基N末端丝氨酸残基发挥水解酰基作用。酶促水解反应是通过酶活性中心和底物分子形成一个四面体中间物进行的，四面体中磺酸基团与半缩醛非常相似。且这一四面体形成和解体是一个可逆的过程，羰基的质子化使得其碳原子
7、更容易受到亲核进攻。-1丝氨酸残基的O处于利于进攻羰基碳原子的位置。丝氨酸的O亲核进攻青霉素G的酰胺键羰基碳原子后形成一个氧负离子四面体中间物，通过23和69的主要酰胺基团及241 Asn侧链的N相互作用从而保持稳定，当释放6APA时，这个四面体中间物就发生解体。接着酰化酶受到水分子的进攻而产生另一个四面体中间物，同样通过23和69的主要酰胺基团与241Asn侧链的N相互作用而稳定，当苯乙酸被释放时，同时这个四面体结构发生解体。 第二章 青霉素酰化酶的固定化酶法生产6-APA大多采用固定化酶，固定化酶同游离酶相比具有明显的优点，比如高稳定性，可以重复使用或者连续使用，容易从反应液中分离，可以有
8、效防止对产物的蛋白污染和微生物污染等。 青霉素酰化酶催化水解青霉素G机理质取决于酶本身和固定化载体，两者相互作用赋予了固定化酶的生物化学、机械以及动力学等性。酶的固定化方法主要有吸附法、共价耦联法、包埋法和交联法，这些方法在青霉素酰化酶的固定化研究中都用应用，按照载体的类型主要分为有载体固定化和无载体固定化技术。 在有载体固定化技术中，由于吸附法特异性低，固定化酶的不够稳定，蛋白质容易从载体上脱落，因此在青霉素酰化酶的固定化中使用越来越少。在共价耦联法中，固定化载体是研究的核心内容之一，Rhm公司在20世纪70年代推出的Eupergit C是最常用的环氧树脂载体，青霉素酰化酶在中性或者碱性的条
9、件下通过亲核攻击使得酶的游离氨基同Eupergit C的环氧基相连，获得的固定化酶稳定性很高，可使用800批后仍具有60%的初始活性。Sephabeads FPEP是另一类环氧基载体，在结构上同Eupergit C非常相似，表面的环氧基密度可高达100mol/ml，这样酶和载体的相互作用很强，可以大大提高青霉素酰化酶的稳定性，在45下悬浮8d酶的活力没有明显损失。Amberlite XAD7是一种多孔聚甲基丙烯酯类树脂，在激活后具有游离的醛基，可以同酶发生共价耦联。除了树脂外，还有醛琼脂糖凝胶和明胶壳聚糖也通常作为青霉素固定化的载体。青霉素酰化酶在无机载体如经过活化的硅胶、分子筛等介孔材料、硅
10、藻土等载体上的固定化研究也得到开展，在无机材料上固定化的优点是材料便宜易得。 青霉素酰化酶也可以通过无载体的固定化技术来实现，交联酶晶体(crosslinked enzyme crystals，CLECs)和交联酶聚集体(crosslinked enzyme aggregates，CLEAs)是最常用的两类固定化技术。交联酶晶体一般分两步进行，首先是将一定浓度的蛋白质溶液结晶，然后采用双功能试剂如戊二醛将酶进行交联，在固定化过程中结晶是获得交联酶晶体的关键。交联酶晶体非常稳定，青霉素酰化酶的交联酶晶体在进行1000批反应后仍然保留了70%的初始活性。由于获得青霉素酰化酶的晶体难度较大，所以交联
11、酶晶体的应用受到一定的限制。Cao等分别采用硫酸铵、叔丁醇和PEG 8000做为沉淀剂，用戊二醛作为交联剂制备了青霉素酰化酶交联酶聚集体，发现用叔丁醇做为沉淀剂获得的交联酶聚集体活性最高。Mateo等采用聚醛葡聚糖作为交联剂获得了高活性的交联酶聚集体。交联酶晶体和交联酶聚集体在有机介质中表现出良好的活性，在非水相酶催化中具有良好的应用前景，Sheldon在这方面做了详细综述。 第三章 青霉素酰化酶催化生产6-APA6-APA是-内酰胺抗生素工业中的重要中间体，经过结构修饰可以获得阿莫西林、氨苄西林等重要的抗生素药物。1970年，GistBrocades(后为DSM的子公司)开始化学法生产6AP
12、A，称为“Delft裂解”，这种化学工艺延续了1020年，由于使用了大量的有毒害试剂，而且需要-40的低温，耗能严重，已经被淘汰。目前，工业生产6-APA都已采用酶法裂解工艺，年产量已经达到20000吨以上25。由于6-APA在-内酰胺抗生素工业中的重要作用及其巨大的市场，青霉素酰化酶生产6-APA的新工艺和新技术不断涌现。 第一节 两相系统中裂解青霉素的研究 (1)水有机相系统 青霉素在发酵结束后，需要在有机溶剂体系中且较低pH2.05.5的条件下进行萃取后成盐，通过结晶获得青霉素的钾盐或者钠盐，再进行溶解后进行酶法裂解。由于这个过程需要进行成盐结晶等复杂的操作，所以研究热点集中于青霉素萃取
13、后在低的pH下直接在两相系统中进行酶法裂解，大大简化了操作工艺流程。两相系统中青霉素G、6-APA和苯乙酸都会在两相中进行分配，苯乙酸在有机溶剂中的分配系数受pH影响很大，所以青霉素的水解平衡依赖于pH。在低的pH下，苯乙酸很容易被萃取到有机相中，6-APA也可以得到结晶，导致产物的浓度不断降低，使反应向水解的方向进行，这样可以获得高的转化率。在正丁醇水双相系统中进行青霉素G的酶水解，通过多级逆流萃取可以获得较高收率，在50mmol/L青霉素G的底物浓度，起始pH为2.9的条件下，6-APA收率可达94%。pH较低时水解青霉素G将导致青霉素G和产物6-APA的降解；较高的pH则有利于青霉素G和
14、6-APA的稳定，pH从3.5提高到5.5，6-APA的降解常数从8.410-3/h降低到3.610-3/h，半衰期从也从82h提高到192h。同时，青霉素酰化酶在pH8.0附近时具有较高的活性，较低的pH并不利于发挥酶的最大催化效率。另外在双相系统中萃取青霉素G的有机溶剂如正丁醇或甲基异丁基甲酮(MIBK)可导致酶的变性，在正丁醇饱和的水溶液下青霉素酰化酶悬浮32d活力下降了58%。针对青霉素酰化酶的不稳定问题，采用反相胶团体系，将青霉素酰化酶包埋在AOT/异辛烷反胶团中，活力与水相相比有提高，水解6h后的转化率可达70%以上。采用亲水化共价交联技术将固定化青霉素酰化酶进行处理，在酶的周围制造一个亲水的微环境，这样固定化青霉素酰化酶在有机溶剂中的稳定性大大提高，选择甲基异丁基甲酮作为两相系统中的有机相，在32、pH8.0的条件下悬浮400h，活力仅损失15%，6-APA收率也可达到96%。可以预言，两相系统的发展将会大大简化青霉素酰化酶水解青霉素G的传统工艺，使酶法生产6-APA的成本大大降低。 (2)浊点系统 非离子表面活性剂溶液与离子型表面活性剂溶液性质不同，在达到一定的温度或者有添加物存在的条件下，溶液会自动分相形成表面活性剂浓度很小的稀相(di
