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1、蛋白质纯化的方法选择随着分子生物学的发展,越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术,并研制成套试剂盒,使基因克隆表达变得 越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的,分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物,以研究其生物学作用,或 者大量生产岀可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说,分子克隆的下游工作显得更难,蛋白纯化工作非常复杂,除了要保证 纯度外,蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白,重复性良好。这就要求应用适应 性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败
2、,因为后者要 求规模化,且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性,以期 对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。1、蛋白纯化的一般原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将 目的蛋白从其他蛋白中纯化岀来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白 从混合物如大肠杆菌裂解物中提取岀来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目 的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等
3、分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并 可以迅速将蛋白与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性 质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨率,常用离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因 素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性,柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力,洗脱峰越窄,柱效越好。仅有好的选 择性,洗脱峰太宽,蛋白照样不能有效分离。2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点2. 1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸,在蛋白质的等电点处若溶液
4、的离子强度特别高或者特别低,蛋白则 倾向于从溶液中析岀。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐,因为它在冷的缓冲液中溶解性好,冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸 铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步,它可以初步粗提蛋白质,去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定,可以短期在这种状 态下保存中间产物,当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题,硫酸铵对不锈钢 器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题,但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉 淀岀来,PEG是一种惰性物质,同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果,在缓慢搅拌下逐渐提高冷
5、的蛋白溶液中的PEG浓度,蛋白沉淀可通过 离心或过滤获得,蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法,因为它只能达到几倍的纯化 效果,而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱岀来。2. 2缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度,但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需 要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀岀来,毫无疑问蛋白是处在高盐环境中,需要想办法脱盐,可用的方法 有利用半透膜透析,通过勤换透析液体去除盐分,此法尚可,但需几个小时,通常要过夜,
6、也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透 析膜夹在两个板中间,板的一侧加缓冲液,另一侧加需脱盐的蛋白溶液,并在蛋白溶液一侧通过泵加压,可以使两侧溶液在数小时内达 到平衡,若增加对蛋白溶液的压力,还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有岀售的脱盐柱,柱内的 填料是小孔径的颗粒,蛋白分子不能进入孔内,先于高浓度盐离子从柱中流岀,从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白 的丢失,缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上,剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。2. 3离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树
7、脂间的相互电荷作用,通过选择不同的缓冲液,同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂(能结合带负电荷的分子)结合,也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种:二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂;羧甲基用于弱的阳离子交换树脂;季铵用于强阴离子交换树脂;甲基磺酸酯用于合力也不同,随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化,蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是 去改变pH值,因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱,利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐 浓度平稳地上升,当离子强度能够中和蛋白的电荷时,蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很
8、难精确控制,所以常用分步 洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比,离子交换特异性更好,有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果,树脂也比较便 宜。值得一提的是,即便是用最精确控制的条件,仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白,还需要其他的纯化步骤。2. 4亲和层析亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留,其他杂蛋白会流过柱子。本方法存在的问题是:单抗非 常昂贵,而且也需先纯化;单抗与目的蛋白结合力太强要用苛刻的条件来洗脱,这会使目的蛋白失活并破坏单抗;混合物中的其他蛋 白如蛋白酶也可能破坏抗体或与它们非特异结合;某些单抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中,也需要从终产物中去
9、除。 亲和柱通常在纯化过程的后期应用,此时标本体积己缩小,大部分的杂质己经去除。谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST) 是最常用的亲和层析纯化标签之一,带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化,但本方法有以下缺点:首先,蛋白上的 GST必须能合适地折叠,形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化;其次,GST标签多达220个氨基酸,如此大的标签可能会 影响表达蛋白的可溶性,使形成包涵体,这会破坏蛋白的天然结构,难于进行结构分析,有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定 能解决问题。另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签,组氨酸的咪唑侧链
10、可亲和结合镍、锌和钻等金属离子,在中性和弱碱性条 件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合,在低pH下用咪唑竞争洗脱。组氨酸标签与GST相比有许多优点,首先,由于只有6个氨基 酸,分子量很小,一般需要酶切去除:其次,可以在变性条件下纯化蛋白,在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力;另外6组氨酸标签 无免疫原性,重组蛋白可直接用来注射动物,也不影响免疫学分析。虽然有这么多的优点,但此标签仍有不足,如目的蛋白易形成包涵 体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏岀混入蛋白溶液,不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧 链,而且柱子也会非特异吸附蛋白质,影响纯化效果。若目的蛋白可与某种碳
11、水化合物特异结合,或者需要某种特殊的辅因子,可将该 碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱,结合后目的蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。2. 5疏水作用层析蛋白是由疏水性和亲水性氨基酸组成的。疏水性氨基酸位于蛋白空间结构的中心部位,远离表面的水分子。 亲水性氨基酸残基则位于蛋白表面。由于亲水性氨基酸吸引了许多的水分子,所以通常情况下整个蛋白分子被水分子包围着,疏水性氨 基酸不会暴露在外。在高盐浓度的环境中蛋白的疏水性区域则会暴露并与疏水性介质表面的疏水性配基结合。不同的蛋白疏水性不同, 与疏水作用力大小也不同,通过逐渐降低缓冲液中盐浓度冲洗柱子,在盐浓度很低时,蛋白恢复自然状态,疏水作用力减
12、弱被洗脱岀来。 疏水性树脂的选择性是由疏水性配基的结构决定的,常用的直链配体为烷基配体(alkyl ligands)和芳基配体(aryl ligands),链越长结 合蛋白的能力也越强。理想树脂种类的选择应根据目的蛋白的化学性质而定,不能选择结合力太强的树脂,结合力太强的树脂会很难洗 脱,所以开始时应选用中等结合力的苯基树脂探讨条件。为了使选择合适的介质更容易,Amersham Biosciences推岀了疏水作用树脂选择 试剂盒,里面包括5种不同的树脂供比较。疏水层析很适合作为离子交换纯化的下一个步骤,因为疏水作用层析在高盐浓度下上样,从 离子交换得到的产物不需更换缓冲液即可使用。蛋白又在低
13、盐缓冲液中洗脱,又省去了下一步纯化前的更换缓冲液的步骤,既节约了时 间,又减少了蛋白的丢失。2. 6排阻层析也叫凝胶过滤或分子筛。排阻层析柱的填充颗粒是多孔的介质,柱中围绕着颗粒所能容纳的液体量叫流动相,也 称无效体积。太大的蛋白不能进入颗粒的孔内,只能存在于无效体积的溶液中,将会最早从柱中洗脱岀来,对这部分蛋白无纯化效果。 由于各种蛋白的分子大小不同,扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异。大的蛋白分子会被先洗脱岀来,分子越小,洗脱岀来的越 晚。为得到最佳的纯化效果,应将孔径大小选在目的蛋白能在无效体积和总柱床体积的中点附近洗脱。排阻层析有其他方法所不具备的 优点,首先所能纯化的蛋白分子量范
14、围宽,Tosoh Biosep公司的聚合物树脂,排阻极限可达200000kD;其次,树脂微孔的形状适合分离 球形的蛋白质,纯化过程中也不需要能引起蛋白变性的有机溶剂。应该注意的是某些蛋白不适合用凝胶过滤纯化,因为本技术所用树脂 有轻度的亲水性,电荷密度较高的蛋白容易吸附在上面。排阻层析从不用于纯化过程的早期,因为这种方法要求标本高度浓缩,上样量 只能在柱体积的1%4%之间,柱子要细而长才能得到好的分离效果,树脂本身也比较昂贵,规模化的工业生产中不太适用。2. 7电泳丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化效果。这种方法分离效果极好,可惜很难在不 丧失精度情况下放大到制备规
15、模,因为随着胶厚度的增加,电泳时的热效应会严重干扰蛋白的泳动。在基础研究中,有时仅需要少量的 纯蛋白进行研究,如蛋白质测序等,此时电泳纯化不失为一种简便快速的好方法。丙烯酰胺凝胶电泳也是蛋白纯化过程中重要的分析工 具,可以检测目的蛋白是在哪个梯度的离子交换柱盐洗脱液中;可用来判定近年来随着各学科的迅猛发展,对蛋白纯化技术的需求不断 增长,己有的纯化方法被日益改进,新型的纯化方法也相继涌现。羟磷灰石是磷酸钙的结晶,由于其理化性质不够稳定,结合能力差, 很难用于层析。近来Bio-Rad公司对其进行了改进,提高了钙和磷的比例,使形成球形、多孔、性质稳定的陶瓷羟磷灰石颗粒,其带正 电的钙离子和负电性的
16、磷酸根离子可分别与蛋白的羧基及氨基结合。通过调整缓冲液的pH值,酸性及碱性氨基酸可选择性地与此树脂结 合,改变缓冲液的盐浓度可将蛋白洗脱分离。资料显示,使用这种方法能使两种等电点、分子量和疏水性相同的蛋白很好分离。亲和纯化方面,Sigma发展了利用FLAG标签的纯化方法,FLA G序列为N-AspTyrLysAspAspAspAsp-Lys-C,分子量小且亲水性, 与其融合表达的蛋白不易形成包涵体,活性也不受影响,用该公司抗FLA G抗体亲和树脂即可纯化目的蛋白。其他新型标签及相应纯化 系统还有 CBP (Calmodulin Binding Peptide, CBP)、Promega 公司的 BCCP (Biofin carboxylcarrierprotein, BCCP)标签和亲和素一生物 素纯化系统、麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein,MBP)标签、Biolabs公司的IMPACT-CN系统、Novagen公司的CBD-Tag 和, I7-Tag系统等。相信随着时间的推移,会有更