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1、混饲：恩诺沙星对小鼠肝微粒体苯胺羟化酶活性的影响2008级动物医学(2)班 王亚指导老师 孙素玲(教授)摘要目的：研究恩诺沙星对小鼠肝微粒体苯胺羟化酶活性的影响。方法：40只小鼠随机分 为5组，公母各半；组II川l,IV, V为试验组。每天分别饲喂剂量为50mg/kg、100mg/kg、 150mg/kg和200mg/kg的氧氟沙星，组I为对照组，每天饲喂相同饲料，每天饲喂前禁食 4h ,后6h开始给食，持续饲喂四周，各组自由饮水。采用钙沉淀法制备小鼠肝微粒体，用 测定代谢生成的对-氨基酚量的方法来测定苯胺羟化酶的活力。结果四个试验组的苯胺羟 化酶的活力分别为 190.45947.406 nm
2、ol/ ( mg.min ) 131.82753.320 nmol/ (mg.min) 32.19610.705 nmol / ( mg.min),对照组为 419.404198.971 nmol/ (mg.min )与对照组相比，4个试验组苯胺羟化酶的活力都显著下降(P 0. 5 g / kgBW(以磺胺间甲氧嘧啶 计)。即M TD大于规定使用剂量25倍以上，休药期应考虑在28d以上。 关于恩诺沙星的研究目前国内只限于对微生态方法,关于恩诺沙星对机体的毒性 作用，肝脏苯胺羟化酶活性的影响报道甚少,为此本试验通过对实验小鼠肝脏苯 胺羟化酶活性影响的动态观察，为评价不同剂量的恩诺沙星对人和动物生
3、物酶活 性的影响，钒的安全评价等提供参考。1材料1.1动物的选择和处理小白鼠40只，体重2023g，安徽科技学院实验动物中心提供。观察饲养两周。 1.2主要试剂恩诺沙星：分析纯，合肥工业大学试剂厂，批号为030516； 0.9%氯化钠溶 液：安徽环球药业股份有限公司，批号为0410252；蔗糖：分析纯，中国医药 集团上海化学试剂公司，批号为H20041215；三羟甲基氨基甲烷：分析纯，北京 化学试剂公司，批号为031009；氯化钾：化学纯，中国上海试剂一厂，批号为 040657；氯化钙:分析纯AR,国药集团化学试剂有限公司，批号为F20040628； 氯化氢溶液：分析纯，上海东懿化学试剂公司，
4、批号为20030910；过氧化羟基 异丙苯：化学纯CP，中国医药集团上海化学试剂公司，批号为T20040110；盐酸 苯胺：分析纯AR，中国医药集团上海化学试剂公司，批号为W20031020；三氯乙 酸：分析纯，上海化学试剂采购供应站经销，批号为030114；无水碳酸钠：化 学纯，山东博山试剂厂，批号为030508；氢氧化钠：分析纯，宜兴市第二化学 试剂厂，批号为030401 ；苯酚溶液：分析纯AR，上海兴达试剂厂出品，批号为 040301；对-氨基酚：化学纯CP,国药集团化学试剂有限公司，批号为F20040816； 硫酸铜：化学纯，合肥工业大学化工厂，批号为040214。1.3主要仪器FA1
5、004N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；YP600型电子天平，上海精 密科学仪器有限公司；TDL802B型低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造; TGL16C型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；DY89I型电动玻璃匀 浆机，宁波新芝科器研究所；THZC恒温震荡器，太仓市光明分析仪器厂；HH S恒温水浴锅，江苏国胜实验仪器厂；BCD502F型冰箱，青岛海尔冰箱股份 有限公司；721型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；1.4药液的配制蔗糖一TrisHcl缓冲液（PH7.4） 称取蔗糖85.6g，三羟甲基氨基甲烷 1.2g，溶解于约800ml蒸馏水中，用盐酸调PH到7.4最后再用蒸
6、馏水定容至 1000ml，放置于冰箱中保存备用。Kcl-Tris-Hcl缓冲液（PH7.4） 称取氯化钾11.2 g，三羟甲基氨基甲烷1.21 g， 溶解于约800ml蒸馏水中，用盐酸调PH到7.4最后再，用蒸馏水定容至l00ml， 放置于冰箱中保存备用。氯化钙（Cacl2）溶液 称取氯化钙5.0 g，用蒸馏水定容至100ml。0.1mol/L的TrisHcl缓冲液（PH7.4）称取三羟甲基氨基甲烷1.21 g， 加约80ml蒸馏水溶液，用盐酸调PH到7.4最后再用蒸馏水定容至100ml，放置 于冰箱中保存备用。过氧化羟基异丙苯溶液称取过氧化羟基异丙苯0.65g，用蒸馏水定容至 lOOml。盐
7、酸苯胺溶液 称取1029g盐酸苯胺，用蒸馏水定容至lOOml。70%三氯乙酸溶液称取三氯乙酸70g，用蒸馏水稀释至100ml。碳酸钠溶液（Na CO ）溶液 称取10.6g，无水碳酸钠用蒸馏水溶解并稀释23100ml。氢氧化钠（NaOH）溶液 称取氢氧化钠4g,用蒸馏水溶解并稀释200ml。 酚试剂 量取苯酚溶液2ml，加NaOH溶液至100ml。0.25mol.L-i对-氨基酚标准溶液 精确称取27.28mg对-氨基酚，用少量的 蒸馏溶解后转移入1000ml容量瓶中加水定容至1000ml。2方法2.1实验动物的分组和染毒方式40只小鼠随机分为5组，公母各半；组II,III,W, V为试验组。
8、每天分 别饲喂剂量为50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg和200mg/kg的氧氟沙星，组I为 对照组，每天饲喂相同饲料，每天饲喂前禁食4h,后6h开始给食，持续饲喂四 周，各组自由饮水。各组的饲养管理条件相同。实验期间细心观察各组小鼠的情 况。2.2样本的采集和处理2.2.1小鼠肝微粒体的制备（钙沉淀法）将小鼠停食24h后，颈椎脱臼处死，迅速剖开腹腔取出肝脏，用预冷的生 理盐水洗净血污，并用滤纸吸干表面的水分。将肝脏称重后置于烧杯中，用手术 直剪剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入蔗糖一TrisHcl缓冲液，用电动玻璃匀 浆机匀浆，转速600 r/min分，研磨上下移动8次。将匀浆倒
9、入量筒，用缓冲液 洗涤匀浆管并将其倒入量筒中，最后缓冲液的体积加至约5ml/g组织。将肝匀浆 转移到离心管中，以600r/min平衡离心5min，弃取沉淀部分（细胞碎片和细胞 核），上清液以12000r/min离心10min,弃取沉淀部分（线粒体）。量取去除线 粒体的上清液的总体积，加入Cacl溶液2ml,以14000r/min离心15min,弃取2上清液，沉淀部分即为粉红色，半透明的微粒体。将微粒体沉淀，混悬于 Kcl-Tris-Hcl缓冲液中，并用玻璃匀浆器充分混均匀，再经14000r/min离心 15min ,其沉淀即为经清洗的微粒体。最后将制备所获得微粒体悬混于 Kcl-Tris-Hc
10、l缓冲液（缓冲液用量约为1ml/g组织）中，用玻璃匀浆器充分混 均匀，并分装后放置于冰箱中保存。使用前按双缩脲法测定微粒体蛋白的含量。 2.2.2微粒体蛋白含量的测定（双缩脲法）取6只试管，分别加入0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升的标准酪蛋白质 溶液，再分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0毫升蒸馏水，然后加入1.0毫 升双缩脲试剂在室温放置30min,于540毫微米波长下比色，最后光密度以Y表 示，酪蛋白的含量以X表示，计算出曲线的回归方程一。吸取1毫升微粒体混悬液，加入1.0毫升的蒸馏水和4.0毫升双缩脲试剂， 与前同样比色，根据吸光度和回归方程一求出微
11、粒体混悬液蛋白的含量。2.2.3苯胺羟化酶的活力的测定9.10取清洁干燥的试管按表1加入试剂，将上述各试管置于37C水浴预温3min 后，按顺序每管加入过氧化羟基异丙苯0.1ml,继续水浴震荡3min,按顺序每管 加入三氯乙酸溶液0.3ml，微粒体悬混液0.5ml。经2000r/min离心10min后， 分别将各管的全部上清液取于另一试管中，加入1ml酚试剂，室温下反应30min。以1号试管作参比，在630nm处比色测定，以吸光度为Y，对-氨基酚的含量为X， 算出回归方程二。表1 标准液的配制试管编号缓冲液（ml）对-氨基酚标准液（ml）相当于对-氨基酚（nmol）11.50021.40.12
12、531.30.25041.20.37551.10.410061.00.512570.90.615080.70.820090.51.0250取清洁干燥的试管按表2加入试剂：表2：样品测定液的配制空白对照管（ml）样品测定管（ml）微粒体0.50.5缓冲液1.41.4苯胺溶液一0.1蒸馏水0.1一以下的操作除不再加微粒体外，其余步骤与标准曲线操作相同。以空白管作 为参比，测样品管测的光密度值，依据回归方程二求出对应的对-氨基酚含量 （nmol），并按下式计算苯胺羟化酶的活力。苯胺羟化酶的活力（nmol/mg.min）=生成的对-氨基酚含量（nmol ） /微粒 体蛋白浓度（mg/ml）X0.5X3
13、2.3统计方法用SPSS 11.0 for windows软件对试验数据的进行统计分析，试验数据以 （元士 $）表示，确定差异显著性作t检验，以P0.05为差异具有统计学意义。3结果与分析3.1回归方程一根据表3所测的数据计算出回归方程一为 Y= 0.065+1.76X ,r=0.9908 根据回归方程一计算出的蛋白质的含量，见附录。根据表4的数据14求出的回归方程二：Y= 0.021+2.858X 10-3 X , r =0.9802 根据回归方程二计算出对-氨基酚的含量，见附录。根据公式：苯胺羟化酶活力（nmol/mg.min）二生成对氨基酚的含量/微粒体蛋 白浓度，计算出苯胺羟化酶活力见表5。表3：标准蛋白质溶液的吸光度试管编号相当于蛋白质（mg/ml）吸光度100220.057340.195460.266580.4706100.5573.2回归方程二表4：标准液的吸光度试管编号相当于对-氨基酚（nmol）吸光度1002250.0693500.1594750.19851000.30261250.42471500.53082000.59492500.
