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1、散发性阿尔茨海默病患者BDNF基因G196A和C270T单体型及双体型分析钱云，张志珺，张晓斌，袁勇贵，宇辉，施咏梅，柏峰，谢春明【摘要】目的：讨论脑源性神经营养因子BDNF基因G196A和270T单核苷酸多态性SNPs在散发性阿尔茨海默病sAD发病机制中的作用。方法：采用聚合酶链反响限制性片段长度多态性PR-RFLP技术，对105例sAD患者和105例安康对照者BDNF基因、载脂蛋白E(ApE)基因多态性进展分析。结果：(1)sAD患者270T但非G196A基因型及等位基因频率与对照组相比差异有统计学意义(P=0.034，P=0.011)。(2)BDNFG196A和270T单体型分析发现，4
2、种单体型在sAD组和对照组间差异有统计学意义(P=0.048)。对照组H4单体型频率显著高于sAD组，差异有统计学意义(P=0.024)；按ApE4分层后，在非ApE4携带者中，该差异仍有统计学意义(P=0.023)。对照组基于H4的双体型频率显著高于sAD组，差异有统计学意义(P=0.029)；按ApE4分层后，在非ApE4携带者中，该差异仍有统计学意义(P=0.040)。结论：BDNF270T位点的SNP可能与sAD的易感性相关，H4单体型及其构成的双体型是sAD的遗传保护因素，对非ApE4携带者而言尤其如此。【关键词】阿尔茨海默病；脑源性神经营养因子；载脂蛋白E；单体型；双体型阿尔茨海默
3、病(AlzhEierdisease，AD)病因目前仍未明确，遗传因素是其发病的重要危险因素1。研究说明，载脂蛋白EaplipprtEInE，ApE4等位基因是散发性ADspradiAD，sAD的危险因素2，但并非4等位基因携带者均开展为AD，提示可能存在其他遗传危险因素。尸检发现，AD患者海马脑源性神经营养因子(brain-derivedneurtrphifatr，BDNF)RNA下降3。胎鼠细胞模型研究发现，BDNF基因G196A单核苷酸多态性singlenuletideplyrphis，SNP可影响该基因的蛋白表达缬氨酸替代蛋氨酸4；有研究发现BDNF基因G196A、270T与AD发病有关
4、5-6，但目前仍存在争议。本研究对sAD患者BDNF基因G196A和270T多态性及其与ApE的互相作用进展分析。1对象与方法1.1对象sAD组患者105例，来自东南大学附属中大医院、南京医科大学附属脑科医院和江苏省扬州五台山医院，男48例，女57例，平均年龄72.896.17岁。痴呆的诊断标准采用美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册第4修订版DS-标准。首先应用简易智能状态量表(SE)、日常生活活动才能量表(ADL)、画钟试验、临床痴呆量表DR初筛有痴呆，然后根据文化程度对可疑痴呆患者进展详细的神经心理学检查，Hahinski缺血指数分4分，Hailtn抑郁量表排除抑郁症，全部进展头部影像
5、学检查T或RI，符合美国神经病学、语言障碍及卒中-AD和相关疾病学会(NINDS-ADRDA)很可能AD诊断标准，无阳性家族史。正常对照组105例，男47例，女58例，平均年龄72.775.79岁，无痴呆家族史，均为安康体检者。受试者均为汉族人，彼此无血缘关系，本人或其监护人知情同意，并获得东南大学附属中大医院伦理委员会的批准。1.2方法1.2.1模板DNA提取取-80冰箱保存抗凝全血，采用KI法提取白细胞基因组DNA7，溶于TE缓冲液，-20保存。1.2.2引物合成引物参照文献5-6,8由上海英俊生物技术合成。1.2.3PR扩增、琼脂糖凝胶电泳及限制性酶切PR扩增产物采用聚合酶链反响限制性片
6、段长度多态性PR-RFLP技术，参照文献5-6,8对BDNFG196A、270T和ApE基因多态性进展分析，见表1。表1BDNFG196A、270T和ApE的引物序列、酶切及电泳条件1.3统计学处理计算各组基因型和等位基因频率，检验其是否符合Hardy-einberg平衡定律。基因多态性位点基因型频率和等位基因频率比拟用2检验。采用SHEsis软件9进展连锁不平衡及单体型分析。在单体型分析根底上，双体型分析根据两个双体型组执行，采用SPSS13.0统计软件对每个双体型进展Fisher准确检验。所有统计检验均为双侧检验，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Hardy-einberg平衡法那
7、么的吻合度检验sAD组和对照组年龄P=0.890及性别P=0.890分布相似，差异无统计学意义。sAD组与对照组3个SNPs基因型观察值与期望值检测符合Hardy-einberg平衡定律，说明其基因型频率分布已到达遗传平衡，具有群体代表性ApEvssAD组2=1.052，P=0.789；vs对照组2=3.017，P=0.389。BDNFG196AvssAD组2=0.008，P=0.929；vs对照组2=0.338，P=0.844。BDNF270TvssAD组2=0.002，P=0.961；vs对照组2=2.688，P=0.101。2.2ApE基因型和等位基因频率分布ApE4基因型在sAD组中占
8、41.9%，对照组中占20.0%，两组差异有统计学意义P=0.001。两组ApE4与非ApE4的R=2.885，95%I为1.5595.340表2。表2sAD组和对照组ApE基因型和等位基因频率分布注：1)ApE4+表示1个或2个拷贝的4；ApE4表示没有4拷贝；2)括号内为所占百分比2.3BDNFG196A、270T基因型和等位基因频率分布BDNFG196A和270T酶切图谱见图1、2。BDNFG196A基因型及等位基因频率在两组间差异无统计学意义P0.05。BDNF270T基因型及等位基因频率在两组间差异有统计学意义，sAD组T等位基因频率显著低于对照组P=0.011，sAD组T及TT基因
9、型显著低于对照组P=0.034，基因型在sAD组中占99.0%，对照组中占91.4%，两组差异有统计学意义2=6.720，P=0.019，R=9.750，95%I为1.21378.397(表3)。表3sAD组与对照组BDNF基因G196A和270T基因型和等位基因频率分布注：括号内为所占百分比2.4BDNF基因G196A和270T连锁不平衡及单体型分析2.5BDNF基因G196A和270T双体型分析在4种单体型分析根底上进展双体型分析，其中两个位点均是杂合子构成双体型频率在对照组中显著高于sAD组sAD组vs对照组为0vs5.7%，差异有统计学意义P0.05。按ApE4等位基因分组发现，非Ap
10、E4等位基因携带者组，两个位点均是杂合子构成双体型频率在对照组中高于sAD组sAD组vs对照组为0vs7.1%，差异有统计学意义P0.05(表5)。表5BDNF基因G196A和270T双体型分析注：括号内为所占百分比3讨论BDNF基因位于11p13-p14，包括13个外显子，其编码的蛋白对神经元的存活非常重要10。人类BDNF主要由海马和大脑皮层的神经元产生，广泛分布于大脑皮层、海马和杏仁复合体，而这些区域在AD极早期即出现老年斑senileplaques，SP和神经纤维缠结neurfibrillarytangles，NFTs11。以上研究提示BDNF基因可能是AD的候选基因。.alzgene
11、.rg网站上列出的关于BDNF基因与AD的22项研究中，有8项发现了阳性结果。关于G196A的11项高加索受试者研究的荟萃分析显示R=1.0895%I为0.981.19，关于270T的7项研究荟萃分析显示R=1.0995%I为0.701.68。我们的研究说明，BDNFG196A基因型及等位基因频率在sAD组与对照组之间差异无统计学意义，A等位基因频率在对照组中为49.5%，与Bian、He和Tsai等12-14对中国人群的研究结果类似，均不增加AD的发病风险。而T等位基因可能是独立于ApE2之外的又一个sAD保护因素。sAD与270等位基因正关联，基因型携带者患AD的风险比非基因型携带者明显增
12、高，这与Desai等15的研究结果相反，可能是由于：(1)该等位基因与真正的致病位点存在连锁不平衡；(2)该等位基因可能是引起疾病的功能位点；(3)由于所选择的研究人群偏倚、人群分层而造成假阳性。ApE4等位基因是公认的sAD的高危因素。我们的结果显示，sAD患者与ApE4等位基因显著正关联，再次验证了ApE与sAD的相关性16。总之，我们首次发现BDNFG196A-270T的单体型和双体型与sAD相关，且对非ApE4等位基因携带者亦然。重复本研究进一步说明BDNF基因多态性及其各位点间单体型、双体型与AD关系以及与ApE基因之间的交互作用很有必要，可能有助于AD的早期诊断，并在A疫苗治疗AD之外提供了神经营养因子干预措施的可能17。致谢卫材中国药业给本研究提供了支持和帮助！
