高级生化实验报告

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1、Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白实验报告一、实验背景印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反 应来检测样品的一种方法。1975年，Southem建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利 用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern blotting。之后, James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授又发明了 RNA杂交检测技 术，因与 Southern blotting 相似，故命名为 Northern blotting。George Stark 这位 教授在两年后又开

2、发出类似的蛋白质检测方法。1981年，在Neal Burnette所著 的Analytical Biochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western blotting。此后开发的 Eastern blotting 是 Western blotting 的变形，对双向 电泳后蛋口质分子的印迹分析称为Eastern blotting。30多年来，Western blotting 技术已成为蛋白质研究中最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在（定性）， 目的蛋白质的表达量和不同样品之间的表达差异性（定量）。免疫印迹法（Western blotting）是一种将高分辨率

3、凝胶电泳和免疫化学分析 技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优 点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定 量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。与Southern或N orthern 杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白 质，“探针“是抗体，“显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移 到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以I古I相载体上的蛋白质或多 肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反

4、应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应, 经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。pET系统是在大肠杆菌（Escherichia coli）中克隆表达目的基因、产生重组 蛋白的经典表达系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录 及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导o T7 RNA聚合酶 被充分诱导吋，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小 时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。目的蛋白可用于进一步的 SDS-PAGE分析、Western blotting检测或

5、亲和层析分离纯化。二、实验目的利用Western Blotting技术，定性检测苦养二氢黄酮醇4还原酶基因(FfDFR) 在E.coli BL(DE3)中的诱导表达。三、实验原理采用PCR技术，在苦养FtDFR基因ORF起始密码子前引入Kpn I酶切位 点，终止密码后引入Sg/I酶切位点。PCR产物与pET-30b ( + )质粒进行体外重 组,获得重组质粒pET-30b- F/DFR,设计其表达产物在N末端含有6 x His标签。 重组质粒经鉴定后转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表 达，分别收集诱导Oh、1 h、2h、3h、4h、5h和6h的产物，经SDS

6、-PAGE后 用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。Western blotting的实验流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE凝胶电泳分离, 进一步通过电泳转移到固相支持物上(硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜)；将 膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特界性吸附，I古I定后含有特定抗原 的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体发生抗原抗体反应，并通过放射、 生色或化学发光的方法进行定位。本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体(Anti-His tag IgG, 一抗)与重组 FtDFR蛋白的N末端的6 x His发生抗原抗体特异反应，利用辣根过氧化物酶 标记羊

7、抗小鼠IgG (peroxidase-Goat Anti- Mouse IgG,二抗)与一抗发生特异结 合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺(3, 3-diaminobenzidine), 是过氧化物酶(Peroxidase)的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而 呈现岀颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶 的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜 显色中应用广泛。四、操作步骤4.1样品的制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为 定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处

8、理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。材料与试剂：基因工程菌重组E. coBL21(DE3)PET3b(+)皿化LB固体培养基(Kan50|ig/mL)LB液体培养基(10mL、50mL)Kan (50 mg/mL)IPTG (24 mg/mL)PBS 缓冲液：137mM NaCl , 2.7mM KC1 , 10mM Na2HPO4,2mMKH2HPO4,pH7.4；5XSDS样缓冲液(pH8.0)： 250mMTris-HCl(pH6.8), 10% (W/V) SDS,0.5% (W/V)澳酚蓝，50% (W/V)甘油，5% (W/V) B 筑基乙醇；仪器与设备：恒温培养箱、恒温摇床、

9、超净工作台、酒精灯、消毒酒精(75%)、棉球、 接种环、台式离心机、Tip (10 jxL、200 pL、1 mL)微量加样器(10(1L 200 |1L 1 mL) 离心管(1.5 mL)o操作步骤： 将基因工程菌E. coBL21(DE3)PET3b(+)-FQFR划线于LB固体培养基(Kan 抗性)，37C培养16h。 挑选单菌落，接种至10 mL LB培养基(按0.1%加入Kan, 10此)于37 C 过夜培养，即为种子液。 按2 %的接种量(1 mL)将种子液接种到50 mL LB Kan培养基中(按0.1% 加入 Kan, 50 yL),于 37 C培养 OD600 至 0.5 (

10、约 2.5 h)。 加入IPTG至终浓度为1 mmol/L (100 pL),置于22-25C连续诱导表达8 h,分别取诱导前Oh,诱导后2h、4h、6 h和8 h的培养液1 mL于1.5 mL离心管中，置于4C备用。 诱导完毕后，各样品丁 12000 rpm离心5 min收集沉淀，用等体积PBS (1mL)重悬漂洗细胞2次，收集菌体。 =1注意事项: 重组蛋白的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗牛素，避免可能的污染。 制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。 多次使用时样品应进行分装，保存于20C或80C且避免反复冻融。SDS-PAGESDS聚丙烯酰胺凝胶电

11、泳(SDS-PAG1)是一种常用的定性分析蛋白质的电 泳方法，多用于分离蛋白质或测定蛋白质相对分子质量。当蛋白质相对分子质量在11700200000之间时，电泳迁移率与分子质量的 对数呈直线关系，符合以下方程式：lgMw二bir+K式中，Mw为蛋白质相对分子质量；b为斜率，niR为电泳相对迁移率，K为 节距。在一定条件下，K和b均为常数，基于这一关系，通过测定儿个标准蛋白 质(即相对分子质量已知)的迁移率，可得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条 件下进行电泳，测得它的相对迁移率，即可在标准曲线上求得其相对分子质量。 材料与试剂： 分离胶缓冲液(1.5mol/LTrisHCl, 0.4% SDS,

12、 pH&8)。 浓缩胶缓冲液(0.5 mol/LTris-HCl, 0.4% SDS, pH 6.8)。 30%丙烯酰胺/N, N-亚甲基双丙烯酰胺(Arc/Bis)： 29.2 g Acr, 0.8 g Bis, 定容至100 mLo TEMED (四甲基乙二胺)。 2XSDS 上样缓冲液(pH8.0)： 250mMTris-HCl(pH6.8), 10% (W/V)SDS,0.5% (W/V)漠酚蓝，50% (W/V)廿油，5% (W/V) B 蔬基乙醇。 电极缓冲液(pH&3) : 3.03 g Tris, 14.41 gGly, l.OgSDS,调整 pH 后定容 至 1000 mLo

13、 电极缓冲液(3.03gTris, 14.41gGly, l.OgSDS,调整 pH=8.3 定容至 1000ml) 封底胶：lg琼脂糖溶于100ml电极缓冲液。 染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250o 脱色液：10% (V/V)乙酸，5% (V/V)乙醇。预染标准分子量蛋口质Markero仪器与设备：MV-III型小型单垂肓板电泳槽及附件、电炉、电泳仪、微量加样器(lOgL),Tip （10pL）o 4.2操作步骤： 制胶槽的安装：将成套的两块玻璃板放置于制胶槽背面上的支架固定（凹 形玻璃板向外），4个铁夹分别夹在玻璃板左右两侧即可制胶。 SDS-PAGE分离范围一

14、般在10-200 kDa,超过这个范围无法进行准确比较。 不同的凝胶浓度适用于不同的相对分子质量范围，根据蛋白质相对分子质量选择 最适的凝胶浓度，如下表所示。本实验选用12.5%的分离胶对重组FtDFR （约 40 kDa）进彳亍分离。试剂分离胶浓缩胶浓度7.5%10%12.5%15%30%4%分离胶缓冲液mL4.04.02.04.04.0-浓缩胶缓冲液mL-0.625Acr/Bis mL4.05.33.358.010.70.375HO mLA*8.06.72.654.01.31.510% AP mL0.30.3050.30.30.075TEMED mL0.0080.0080.0080.008

15、0.0080.005 制胶：配制12.5%的分离胶，灌入两玻璃板之间，加至凹形玻璃板顶端2cm 处，立即覆盖5mm左右水层，静置聚合。当分离胶与水层之间的界面重新出现 时表明已胶已聚合。小心倒掉分离胶上水层，配制4%浓缩胶后加入玻璃板中， 插入梳子并及时补充由于浓缩胶聚合产生的空隙。 电泳槽安装：浓缩胶聚合后，除去4个铁夹，正确安装进入电泳槽（凹形 玻璃板向内）并用白色塑料夹将玻璃板固定。 点样：分别于内外槽加入适量电极缓冲液，使内槽水位超过凹形板缺口。 使用微量加样器分别于制胶孔中加入诱导后的样品5-10gL,预染标准分子量蛋 白质点10gLo 电泳：接通电源，待指示剂在分离胶中迁移5cm吋，停止电泳。 剥胶：小心剥胶，将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切 去（便于识别）。Western Blotting做到此处为止。 染色：凝胶加入适量染色液，电炉加热处理15 min染色。 脱色：使用蒸憾水漂洗取出染色液，加入脱色液，电炉加热脱色至出现清 晰的蛋口条带。注意事项： 上样总体积一般5-10|iL左右，胶孔的最大限度可加