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1、荧光光谱分析仪荧光光谱分析仪第一页，共八十九页。荧光光谱分析仪的原理与结构荧光光谱分析仪的原理与结构荧光光谱分析仪的特点和应用荧光光谱分析仪的特点和应用 原子光谱分析仪的原理与结构原子光谱分析仪的原理与结构原子光谱分析仪的特点和应用原子光谱分析仪的特点和应用主 要 内 容第二页，共八十九页。第一节 荧光光谱分析仪第三页，共八十九页。荧光：某些物质吸收光能量后，可发射波长与激荧光：某些物质吸收光能量后，可发射波长与激发光波长相同或不同的光，当激发光源停止照射发光波长相同或不同的光，当激发光源停止照射试样时，再发射过程立即停止，这种再发射的光试样时，再发射过程立即停止，这种再发射的光称为荧光（称为
2、荧光（fluorescencefluorescence）。荧光包括分子荧光和）。荧光包括分子荧光和原子荧光。原子荧光。荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强度荧光分析法：通过测定物质分子产生的荧光强度进行物质的定性与定量分析的方法。进行物质的定性与定量分析的方法。荧光光谱仪：采用荧光分析法来测量的仪器。荧光光谱仪：采用荧光分析法来测量的仪器。一、概一、概 述述第四页，共八十九页。荧光产生机制荧光产生机制 物质的分子吸收了照射光的能物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基态最低能级的分子被激发到电子量后，处于基态最低能级的分子被激发到电子激发态的各个振动能级。被激发的分子与周围激发态的各个振动能
3、级。被激发的分子与周围的分子碰撞，并把部分能量以热能的形式传给的分子碰撞，并把部分能量以热能的形式传给周围的分子，自己降落到单线第二电子激发态周围的分子，自己降落到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后的最低振动能级。然后，由此最低振动能级向由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，同时以发光的形式基态的各个振动能级跃迁，同时以发光的形式释放出其能量。这种光即为荧光。释放出其能量。这种光即为荧光。一、概一、概 述述第五页，共八十九页。1.振动弛豫振动弛豫 2.内转换内转换 3.猝灭猝灭 4.系间跨越系间跨越 s单重态单重态T多重态多重态1 ,2激发波长;荧光3磷光分子去活化过程及荧光产生示意图
4、分子去活化过程及荧光产生示意图一、概一、概 述述第六页，共八十九页。荧光分析的特点荧光分析的特点J优点：优点：灵敏度高（可达灵敏度高（可达101012g12g数量级）；选数量级）；选择性强，有利于分析复杂的多组分混合物；择性强，有利于分析复杂的多组分混合物；用样量少、特异性好、操作简便。用样量少、特异性好、操作简便。L缺点：缺点：对温度、对温度、pHpH值等因素变化比较敏感；值等因素变化比较敏感；应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，应用范围较窄，只能用来测量发荧光的物质，或与某些试剂作用后发荧光的物质。或与某些试剂作用后发荧光的物质。一、概一、概 述述第七页，共八十九页。（一）激发光谱和荧
5、光光谱（一）激发光谱和荧光光谱 任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即激任何发射荧光的物质都具有两个特征光谱，即激发光谱发光谱（excitation spectrum）和荧光光谱荧光光谱(fluorescence spectrum)。激发光谱和荧光光谱是荧光分析中定性和定量的基础。激发光谱和荧光光谱是荧光分析中定性和定量的基础。二、荧光分析的基本原理二、荧光分析的基本原理 第八页，共八十九页。激发光谱激发光谱：连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长的激发光照射下，物质溶液发射的荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，即可得到荧光物质 的激发光谱。 从激发光谱图
6、上可找到 发生荧光强度最强的 激发波长ex。二、荧光分析的基本原理二、荧光分析的基本原理第九页，共八十九页。荧光光谱：用荧光光谱：用exex作激发光源，并固定强度，测定作激发光源，并固定强度，测定不同波长的荧光强度。不同波长的荧光强度。以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得荧光以荧光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图，便得荧光光谱。荧光强度最强的波长为光谱。荧光强度最强的波长为em em 。荧光物质的荧光物质的exex和和emem 是鉴定物质的依据，也是鉴定物质的依据，也 是定量测定中所选用的是定量测定中所选用的 最灵敏的波长最灵敏的波长。二、荧光分析的基本原理二、荧光分析的基本原理第
7、十页，共八十九页。（二）物质的分子结构和荧光的关系（二）物质的分子结构和荧光的关系强荧光物质的分子结构特征：强荧光物质的分子结构特征： 具有大的共轭具有大的共轭- 双键结构，共轭体系越大，越容双键结构，共轭体系越大，越容易产生荧光；易产生荧光； 具有刚性平面结构；具有刚性平面结构； 具有最低的单线电子激发态，具有最低的单线电子激发态，S S1 1为为- 型；型； 若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加。若取代基团为给电子取代基，荧光强度增加。二、荧光分析的基本原理二、荧光分析的基本原理第十一页，共八十九页。三、荧光光谱仪的原理与分类三、荧光光谱仪的原理与分类 荧光光谱仪的工作原理荧光光谱仪的工
8、作原理 在激发光的频率、强度以及液层厚度不变的情况在激发光的频率、强度以及液层厚度不变的情况下，荧光物质所发射的荧光强度与溶液的浓度成正比。下，荧光物质所发射的荧光强度与溶液的浓度成正比。因此，可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。因此，可以通过测定荧光强度来求出该物质的含量。 荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强荧光分析法所测量的是待测物质所发射的荧光强弱，属于发射光谱分析，荧光光度计和荧光分光光度弱，属于发射光谱分析，荧光光度计和荧光分光光度计属于发射光谱仪器。计属于发射光谱仪器。第十二页，共八十九页。荧光光谱仪分类荧光光谱仪分类荧光光度计（荧光光度计（fluorophotomet
9、erfluorophotometer）：采用）：采用滤光片滤光片做做单色单色器，结构较简单，功能也较差。器，结构较简单，功能也较差。荧光分光光度计（荧光分光光度计（fluorospectrophotometerfluorospectrophotometer）：）： 采用棱镜或光栅为色散元件，结构较复杂，功能较采用棱镜或光栅为色散元件，结构较复杂，功能较强，但价格远远高于荧光光度计。强，但价格远远高于荧光光度计。 三三、荧光光谱仪的原理与分类、荧光光谱仪的原理与分类第十三页，共八十九页。三、荧光光谱分析仪的原理与分类三、荧光光谱分析仪的原理与分类 Fluoscence荧光分光光度计第十四页，共八
10、十九页。FP-6500FP-6500荧光分光光度计荧光分光光度计三、荧光光谱仪的原理与分类三、荧光光谱仪的原理与分类 第十五页，共八十九页。三、荧光光谱分析仪的原理与分类三、荧光光谱分析仪的原理与分类 JascoJasco荧光光谱仪荧光光谱仪第十六页，共八十九页。三、荧光光谱仪的原理与分类三、荧光光谱仪的原理与分类 ARL 9800 ARL 9800 系列系列 X X射线荧光光谱仪射线荧光光谱仪 第十七页，共八十九页。荧光光谱仪的主要结构荧光光谱仪的主要结构激光光源：常用汞弧灯、氢弧灯及氘灯等。激光光源：常用汞弧灯、氢弧灯及氘灯等。单色器：一是激发单色器，用于选择激发光波长；二单色器：一是激发
11、单色器，用于选择激发光波长；二是发射单色器，用于选择发射到检测器上的荧光波长。是发射单色器，用于选择发射到检测器上的荧光波长。样品池：放置测试样品，用石英做成。样品池：放置测试样品，用石英做成。检测器：接受光信号并将其转变为电信号。检测器：接受光信号并将其转变为电信号。记录显示系统：检测器出来的电信号经过放大器放大后，记录显示系统：检测器出来的电信号经过放大器放大后，由记录仪记录下来，并可数字显示。由记录仪记录下来，并可数字显示。 四、荧光光谱仪的结构四、荧光光谱仪的结构第十八页，共八十九页。光源光源光源光源激发激发单色器单色器单色器单色器吸收池吸收池吸收池吸收池检测放大系统检测放大系统检测放
12、大系统检测放大系统荧光光度计结构示意图荧光光度计结构示意图0.200.208 8发射发射单色器单色器单色器单色器四、荧光光谱仪的结构四、荧光光谱仪的结构第十九页，共八十九页。四、荧光光谱仪的结构四、荧光光谱仪的结构第二十页，共八十九页。荧光分光光度计光路图荧光分光光度计光路图四四、荧光光谱仪的结构、荧光光谱仪的结构第二十一页，共八十九页。 荧光光谱仪的性能指标主要包括：荧光光谱仪的性能指标主要包括：灵敏度灵敏度波长范围波长范围波长精度波长精度分辨率分辨率光谱带通光谱带通信噪比信噪比五、荧光光谱仪的性能指标五、荧光光谱仪的性能指标第二十二页，共八十九页。灵敏度灵敏度灵敏度是指能被仪器检出的最低信
13、号，或某一标准荧光物灵敏度是指能被仪器检出的最低信号，或某一标准荧光物质稀溶液在选定波长的激发光照射下能检出的最低浓度，质稀溶液在选定波长的激发光照射下能检出的最低浓度，是仪器最重要的性能指标之一。是仪器最重要的性能指标之一。多数荧光光谱仪的灵敏度较高，可达多数荧光光谱仪的灵敏度较高，可达1010-10-10g g1010-12-12g g水平，水平，有利于检测体液中的微量物质。有利于检测体液中的微量物质。五、荧光光谱仪的性能指标五、荧光光谱仪的性能指标第二十三页，共八十九页。波长范围波长范围波长范围指荧光光谱仪的有效工作波段，包括激发通波长范围指荧光光谱仪的有效工作波段，包括激发通道波长范围
14、、投射通道波长范围和荧光通道波长范围。道波长范围、投射通道波长范围和荧光通道波长范围。波长范围越大，应用范围越广。波长范围越大，应用范围越广。一般荧光分光光度计都采用氙灯作光源，光栅为单色器分一般荧光分光光度计都采用氙灯作光源，光栅为单色器分光元件，其有效工作波段在光元件，其有效工作波段在200nm200nm1000nm1000nm范围之内。范围之内。五五、荧光光谱仪的性能指标、荧光光谱仪的性能指标第二十四页，共八十九页。波长精度波长精度指其波长计数器的指示值与真实光波长的数值相符的程指其波长计数器的指示值与真实光波长的数值相符的程度。度。特定的激发波长和发射波长是定性分析和定量测定的基特定的
15、激发波长和发射波长是定性分析和定量测定的基础，因此波长精度也是荧光光谱仪的核心指标之一。础，因此波长精度也是荧光光谱仪的核心指标之一。目前荧光分光光度计的波长精度误差在目前荧光分光光度计的波长精度误差在（0.2nm0.2nm2nm2nm）范围之内。）范围之内。五、荧光光谱仪的性能指标五、荧光光谱仪的性能指标第二十五页，共八十九页。分辨率分辨率指荧光仪器对靠近的峰尖分开的能力，它与波长精度指荧光仪器对靠近的峰尖分开的能力，它与波长精度有密切关系，决定着对混合物成分分析特异性的好坏。有密切关系，决定着对混合物成分分析特异性的好坏。常用仪器的分辨率在常用仪器的分辨率在0.2nm0.2nm5nm5nm
16、之间，主要由光栅的每之间，主要由光栅的每毫米刻线数决定。毫米刻线数决定。五、荧光光谱仪的性能指标五、荧光光谱仪的性能指标第二十六页，共八十九页。光谱带通光谱带通指仪器主机狭缝宽窄程度的指数。指仪器主机狭缝宽窄程度的指数。以一定狭缝几何密度对应的光谱半宽度来直接表示光以一定狭缝几何密度对应的光谱半宽度来直接表示光谱纯度。谱纯度。光谱纯度直接影响仪器的分辨率、灵敏度以及背景干光谱纯度直接影响仪器的分辨率、灵敏度以及背景干扰。扰。目前的荧光分光光度计的光谱带通在目前的荧光分光光度计的光谱带通在0.15nm0.15nm20nm20nm之之间，一般都采用连续可调方式。间，一般都采用连续可调方式。五、荧光光谱仪的性能指标五、荧光光谱仪的性能指标第二十七页，共八十九页。信噪比与响应速度信噪比与响应速度用空白样品测得的峰值叫做噪声峰值，待测样品测得的峰用空白样品测得的峰值叫做噪声峰值，待测样品测得的峰值和噪声峰值之比就叫做信噪比。值和噪声峰值之比就叫做信噪比。信噪比越高，检测结果的准确性也越高。信噪比越高，检测结果的准确性也越高。仪器的响应速度是指电路样品通道对光电信号反映的仪器的响应速度是指电路样品
