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1、Word文档标准菌验收、制备、保藏、 传代、使用、销毁的管理 依据: 中国药典2021年版二部及菌种使用说明书 1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）供应的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心供应的冷冻干燥菌种的标签CMCC（B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的。 2.标准菌的验收 从菌
2、种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上全部的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于20，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2 8 ，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3.2培育基 改
3、良马丁琼脂培育基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培育基:用于生孢梭菌复苏、复壮.养分肉汤培育基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。改良马丁培育基:用于白色念珠菌复苏、复壮. 3.3操作步骤： a.打开干净工作台。b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必需当心，由于安瓿遇热时可能会裂开）。d.以无菌方法用一无菌吸管从已预备好的上述液体培育基中移取0.50.8 ml到安瓿中。e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培育基充分混合并完全溶解。f.用无菌
4、吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培育基。g.依据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培育于相应的温度（细菌培育温度3035，培育1824小时；真菌培育温度2328，培育35天。观看是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培育时间至7天，真菌应延长培育时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液溶化后用无菌吸管吸取管内液体12滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布匀称，置2328培育57天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培育基略带黄色。确认后用含有0.05%（ml/ml）的吐温-80的0.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
5、i.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培育基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按挨次进行编号，最终一支做为质控管进行质量掌握，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按挨次进行编号，最终一支做为质控管进行质量掌握，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种、编号、代次
6、、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。j储备菌种管制备胜利，储存于20，有效期为三年。 3.4菌种确认 用无菌接种环从质控管中取细菌培育物接种到养分琼脂培育基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分别出单个菌落。然后在3035下培育23天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培育基平板，并在2328下培育7天；培育后，观看其菌落形态，应符合该菌种形态特征。 3.5污染处理 假如在该平板上发觉有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培育物灭菌处理。可查找缘由重新分别选择纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管 3.6菌种的传代与保藏 将菌种接种至一新奇培育基
7、上，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至新培育基内生长，即认为已传代一次，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥的菌种为第0代，冷冻干燥的原始菌种开启后转种后为第1代，直到第3代为工作菌种。菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代。 菌种的传代保藏过程 3.3项下标准菌的复苏为传第一代，复壮为其次代。传第三代时取1支冻存管自然解冻，将其转接斜面菌种作为工作用菌种。此时，工作用菌种为第3代。工作用菌种，分为两类：一类用于定期传代(W3)，一类用于试验用（S3）。定期传代用菌的传代其操作步骤如下（斜面接种法）：（1）从冰箱冷藏室中取出菌种斜面后，应在室温放置约30分钟。（2）将装有新奇配
8、制的培育基菌种保藏管管壁上注明菌名及接种日期，和传代菌种一并移入干净工作台，打开紫外灯照耀一小时。（3）关闭紫外灯。点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰上方，右手拿接种棒后端，将接种环烧红约30秒，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，来回通过三次。（4）右手用无名指、小指及掌部夹住管塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔开管塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷后再至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒并将菌种管口移至火焰上方。（5）塞上管塞，左手将菌种管放下，取养分琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面）一支，照上述操作打开管塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部向上划一条直线
9、，然后从底部向上作连续曲线划线，始终划到斜面顶端，使细菌接种在斜面的表面上。（6）取出接种环，在火焰上方将培育基管盖上塞子，然后将接种过细菌的接种环在火焰上烧灼灭菌。（7）将已接种好的细菌管置3035细菌培育箱培育22 24h，真菌管置2328真菌培育箱最多培育7天。当工作用菌种传代代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如：（W3）可直接转接为（W4）。按上述程序操作，直至（W4）转为（W5）为止，需重新接种，旧的工作菌种进行销毁。菌种斜面的培育、保藏条件准时间 菌种 培育条件准时间 培育基 保存条件准时间 大肠埃希菌(CMCC(B)44102) 303522 24h养分
10、琼脂培育基 2 8 保存3个月金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003) 303522 24h 养分琼脂培育基 2 8 保存3个月枯草芽孢杆菌(CMCC(B)63501) 303522 24h 养分琼脂培育基 2 8 保存3个月铜绿假单胞菌(CMCC(B)10104)303522 24h 养分琼脂培育基 2 8 保存3个月乙型副伤寒沙门菌(CMCC(B)50094) 303522 24h 养分琼脂培育基 2 8 保存3个月生孢梭菌(CMCC(B)64941) 303522 24h 养分琼脂培育基 2 8 保存3个月白色念珠菌(CMCC(F)98001) 2328 最多7天 改良马丁琼脂培育基 2 8 保存3个月黑曲霉(CMCC(F)98003) 2328 最多7天 改良马丁琼脂培育基 2 8 保存3个月短小芽孢杆菌(CMCC(B)63602) 303522 24h 养分琼脂培育基 2 8 保存3个月注：菌种斜面1次/周观看状态是否正常。 3.7菌种的使用及销毁 每次进行菌种复活时，只能复活一个菌种。假如要复活其他菌时，应对所用物品重新消毒灭菌。每次操作，都应进行记录。菌种管上应贴有坚固的标签。标明菌种名称、菌种、代次、传代人、编号和传代日期、贮存条件、有效期至等。废弃菌种及试验用品废弃物的处理：121 高压蒸汽灭菌30分钟。并对操作过程进行记录。7
