严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件第二节 重组体导入受体细胞的原理与技术 一、重组DNA导入大肠杆菌的方法 二、重组DNA导入真核细胞的方法 三、转化率及影响因素严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件一、重组DNA导入大肠杆菌的方法相关概念1.转化(transformation)细菌获得外源质粒DNA，产生新的遗传性状的过程2.转导(transduction)以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程3.转染 (transfection)指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程转导和转染的区别转导：通过噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程 转染：噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件一）转化（transformation）（1）热激法（heat shock）（2）电转化法（electronporation）（3）PEG介导的原生质体转化（4）接合转化严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。
做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件一、重组DNA导入大肠杆菌的方法1、化学转化法感受态：细菌能从周围环境中吸收DNA的生理状态称为感受态(competence). 感受态的出现是由于细菌表面出现许多DNA结合位点，这些位点只能与双链DNA结合，而不与单链DNA结合 这说明完整的双链结构对于转化活性来说是必要的对于大肠杆菌细胞，一般采用CaCl2溶液来处理受体细胞，增加细胞膜的通透性，制备感受态细胞严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件一、重组DNA导入大肠杆菌的方法严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件一、重组DNA导入大肠杆菌的方法细菌感受态细胞的制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4On ice 5-10 min4离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4离心收集菌4离心收集菌分装、-70 冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬On ice 30 min用冰冷的60mMCaCl2重悬严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。
做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件一、重组DNA导入大肠杆菌的方法重组体导入受体细胞10ng载体DNA100L感受态菌 On ice混合，静置30分钟37摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA加入1mL LB培养基42C 1.5分钟热休克法热休克法简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件一、重组DNA导入大肠杆菌的方法平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37过夜严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件一、重组DNA导入大肠杆菌的方法2.电击转化法 将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场 在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 原理: 用高压脉冲电流击破细胞膜或击成小孔，使各种大分子(包括DNA)通过这些小孔进入细胞. 转化效率高（高于109/gDNA）严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。
做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件一、重组DNA导入大肠杆菌的方法LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2离心集菌冰冷的水重悬菌体2 离心集菌冰冷的水重悬菌体2 离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成 50-300L 电转仪调为2.5kV,25F 脉冲控制器200-400 0.5g质粒DNA On ice混合加入1mLSOC培养液37 中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化电击转化法严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件二） 转导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程（三） 转染噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程与转化无本质区别体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑每g DNA能形成106个噬菌斑 现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件。
体外包装过程 严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件二、重组二、重组DNADNA导入真核细胞导入真核细胞（一）导入酵母细胞1. 原生质体转化2. 碱金属离子介导的完整细胞转化3. PEG1000转化法4. 电击法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件1. 利用原生质体进行转化 酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2 PEG插入外源基因的载体转化转化细胞达原生质体总数的1%2%，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的25%33%严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件 酵母0.1mol/L LiCl 处理感受态2. 碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体40% PEG4000热激涂布选择性平板，筛选转化子 吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。
做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件4. 电击转化（1）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，105个 / g DNA（3）单链转化率高于双链3. PEG1000转化PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件二、重组二、重组DNADNA导入真核细胞导入真核细胞（一）导入酵母细胞1. 载体介导的转化（农杆菌介导）2. DNA直接导入（基因抢法、电击法等）3. 种质系统法（花粉管通道法等）（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件二）导入植物细胞1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件二）导入植物细胞1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。
做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件二）导入植物细胞1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法通过农杆菌侵染植物外植体严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件二）导入植物细胞1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件在饲养平皿的滤纸上培养2天叶叶盘盘法法的的具具体体操操作作 严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术DNA1.2m钨弹头 吸附金属微粒加速，进入受体细胞基因枪装入2. 2. 基因枪法（基因枪法（gene gungene gun） 外植体制备轰击外植体培养及选择严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件基因枪严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。
做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件具具体体操操作作 1. DNA微弹的制备2. 外植体的制备3. DNA微弹轰击4. 外植体的培养严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液电击处理愈伤组织幼苗分化3. 3. 电击法（电穿孔法）电击法（电穿孔法）选择培养严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件二、重组二、重组DNADNA导入真核细胞导入真核细胞（一）导入酵母细胞1. 磷酸钙沉淀法2. 脂质体介导法3. 显微注射法4. DEAE-葡萄糖转染法（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件原理：（三）导入动物细胞1. 磷酸钙沉淀法通过磷酸钙-DNA共沉淀，将外源基因导入哺乳动物细胞依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。
严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件2. 2. 脂质体介导法脂质体介导法脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件脂质体（lipofectin）载体法严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上3. 3. 显微注射法显微注射法1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段2）收集受精卵：受孕后几小时内3）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核4）受精卵移植严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度。
做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件显微注射法(microinjection)严格执行突发事件上报制度、校外活动报批制度等相关规章制度做到及时发现、制止、汇报并处理各类违纪行为或突发事件二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA4. DEAE-4. DEAE-葡萄糖转染法葡萄糖。