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1、根吸收不同时期PDLSCs通过NK细胞发挥破骨分化的调节作用研究乳牙生理性根吸收是乳恒牙替换过程中发生的正常生理活动,是恒牙列咬合顺利建立的必要前提条件1。目前研究认为影响乳牙生理性根吸收的因素包括咀嚼压力、继承恒牙胚压力、遗传因素等,而其具体机制尚未清楚2。现有的关于乳牙生理性根吸收机制的研究主要集中在成骨细胞与破骨细胞所介导的骨吸收作用上,普遍认为牙根吸收过程类似于骨吸收过程。课题组前期研究证实乳牙牙周膜干细胞(periodontalligamentstemcells,PDLSCs)参与乳牙生理性根吸收过程,调节破骨分化,影响根吸收进程3。同时有研究证实乳牙PDLSCs可以通过分泌细胞因子
2、发挥免疫调控作用。有学者发现在骨吸收过程中,免疫细胞发挥重要的调节作用4。还有学者发现自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK)分泌的干扰素(interferon-,IFN-)可以通过对核因子B受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactor,RANKL)的平衡效应抑制破骨分化5。而乳牙PDLSCs是否通过NK细胞进行免疫调节从而在生理性根吸收过程中发挥作用罕见研究6,7,8。本实验检测了NK细胞与不同根吸收期乳牙PDLSCs共培养后,NK细胞分泌IFN-能力的变化,旨在探究生理性根吸收过程中乳牙PDLSCs通过NK细胞对破骨分化调节作用。1、材
3、料与方法1.1主要材料与试剂收集因乳牙滞留拔除的健康乳前牙以及因正畸需要拔除的健康第一前磨牙(空军军医大学口腔医院儿童口腔科、颌面外科),所收集牙齿均告知家长或患者并签署知情同意书。-MEM培养液、胎牛血清(Gibco,美国);TrizolReagen(Invitrogen,美国);SYBR试剂盒(Takara,日本);CFXreal-timePCR系统(Bio-rad,美国);鼠抗人Stro-1、CD34、CD146、CD14、CD31、CD90、CD105、CD44抗体及人IFN-ELISA试剂盒(Abcam公司,英国),倒置相差显微镜(Olympus,日本)。1.2方法1.2.1样本的收
4、集与分类参考本课题组前期分组标准6,对收集到的乳牙及恒牙进行分类:将牙根未吸收的乳牙标本作为吸收稳定期A组、牙根舌侧吸收长度约1/2的标本作为吸收中期B组、牙根舌侧吸收长度大于2/3的标本作为吸收晚期C组,因正畸治疗需要而拔除的第一前磨牙作为恒牙组D组进行对照。1.2.2乳牙PDLSCs的分离培养将收集到的乳、恒牙样本在无菌条件下保存。采用酶消化法(胶原酶消化60min后组织块接种至6孔板获取原代乳牙和恒牙PDLSCs。采用有限稀释法克隆纯化。将各组细胞分别标记为:吸收稳定组(A)、吸收中期组(B)、吸收晚期组(C)、恒牙组(D)。1.3NK细胞与乳牙PDLSCs、RAW264.7细胞共培养N
5、K细胞、RAW264.7细胞购自北纳生物公司,取NK细胞(密度为1105/mL)与分离培养第3代各期乳牙PDLSCs(密度为2106/mL)各1mL于8块6孔板细胞培养板中共培养,置37、5%CO2恒温培养箱孵育,共孵育12h。1.4ELISA检测观察共培养前后的NK细胞的IFN-的分泌水平变化,选取根吸收中期组(B)收集各孔上清液1mL,采用ELISA试剂盒(Abcam公司)检测上清液中IFN-水平。根据浓度梯度将样品与标准品加到酶标包被板上,用封板膜封板后置37温育30min。弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30s后弃去,重复5次。每孔加入酶标试剂50L,空白孔除外。用封板膜封板后置3
6、7温育30min。每孔先加入显色剂A50L、显色剂B50L,37避光显色15min。每孔加终止液50L,终止反应。以空白孔调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。1.5实时定量PCR检测取上述各组共培养体系中的悬浮细胞即为NK细胞,分别提取其总RNA并反转录合成cDNA;然后以cDNA为模板,以-actin为内参进行PCR增殖,分别检测各组细胞中IFN-的表达水平。取各组共培养体系中的RAW264.7细胞,分别提取其总RNA并反转录合成cDNA;然后以cDNA为模板,以-actin为内参进行PCR增殖,分别检测各组细胞中RANKL、OPG的表达水平,具体引物序列见表1。表1引物序列
7、1.6Westernblot检测取各共培养体系中RAW264.7细胞,对细胞总蛋白进行提取,检测RANKL、OPG蛋白表达。提取总蛋白,使用PierceBCAProteinAssaykit测定;配制浓缩胶与分离胶;蛋白SDS-PAGE电泳:统一蛋白量,电压恒定,转膜:设定恒定电压为100V,时间为1.5h;抗体孵育:采用TBST缓冲液对一抗进行稀释,4条件下孵育12h。以11000的浓度对山羊抗兔二抗进行稀释,37的温度条件下孵育1h;TBST缓冲液洗膜,重复3次,每次持续10min。将同体积发光液A液和B液混合,于黑暗的环境中将发光混合液滴加于PVDF膜的正面,检测条带。1.7统计学方法使用
8、SPSS16.0软件对数据进行分析,组间差异采用单因素方差分析,组内差异采用t检验。P0.05表示有统计学意义。2、结果2.1生理性根吸收不同时期PDLSCs的分离培养组织块接种37d后可以观察到细胞从组织块边缘爬出,细胞呈长梭形,放射状生长。细胞核呈卵圆形,位于细胞质中央,各组细胞形态类似(图1)。2.2PDLSCs表面标志物的鉴定结果流式细胞仪检测PDLSCs表面抗原表达水平,结果显示所培养的PDLSCs表达间充质干细胞细胞表面标志物Stro-1,CD146,CD105和CD90,而阴性表达造血系标志物CD34和CD45(图2)。图1各组原代PDLSCs形态(倒置显微镜)观察图2PDLSC
9、S表面标志物鉴定2.3不同根吸收期乳牙PDLSCs与NK细胞共培养后NK细胞IFN-变化实时定量PCR结果显示,A、B、C、D各组的PDLSCs与NK细胞进行共培养12h后,各乳牙组NK细胞IFN-表达水平均降低,分别与恒牙组相比有统计学差异(P0.05),各乳牙组比较,B组NK细胞IFN-下调幅度最大,与其他组相比均有统计学意义(P0.05)。ELISA结果显示,B组NK细胞IFN-表达显著降低,明显低于其他各组(P0.05),与实时定量PCR结果一致(图3)。2.4抑制乳牙PDLSCsTGF-分泌后NK细胞IFN-的表达情况图3各共培养组中NK细胞IFN-的表达实时定量PCR显示,在外源性
10、TGF-作用于B组共培养体系24h后,IFN-表达明显下降,具有统计学意义(P0.05)。在加入TGF-抑制剂IL-2作用于共培养体系24h后,IFN-表达明显高于外源性TGF-组,结果具有统计学意义(P0.05)。ELISA结果与实时定量PCR结果一致(图4)。图4阻断根吸收中期组TGF-后NK细胞IFN-的表达2.5与NK细胞或根吸收中期组PDLSCs共培养后RAW264.7细胞RANKL/OPG基因表达的检测实时定量PCR结果显示(图5),NK细胞组与对照组相比,RAW264.7细胞RANKL基因表达降低,同时骨保护素(osteprotegerin,OPG)表达基因表达增高,统计后显示R
11、ANKL/OPG比值相对降低,差异具有统计学意义(P0.05);PDLSCs组与对照组相比,RAW264.7细胞RANKL基因表达升高,同时OPG基因表达降低,统计后显示RANKL/OPG比值相对升高,差异具有统计学意义(P0.05);上清液组与NK组相比,RAW264.7细胞RANKL/OPG比值升高;上清液组与PDLSCs组相比,RANKL/OPG比值相对降低,差异均具有统计学意义(P0.05),表明乳牙根吸收中期组PDLSCs能够降低NK细胞对破骨分化的抑制作用。图5各组RAW264.7细胞中RANKL、OPG的表达3、讨论当前关于乳牙生理性根吸收研究的重点往往集中于破骨分化相关通路,未
12、对生理性根吸收过程中免疫细胞的参与和发挥的作用进行过多的探究9,10,11。而在生理性乳牙根吸收过程中,多种细胞、细胞因子形成了复杂的细胞微环境,其中存在着大量的免疫细胞及免疫因子12,13,14,15。已有研究证实,在根吸收过程中乳牙牙髓及牙周组织中免疫活性细胞大量增加,包括B细胞、DC细胞、NK细胞、T细胞等16,17,18。NK细胞所分泌的IFN-抑制破骨前体细胞向破骨细胞进行分化发,IFN-可以干扰核转录因子B(nuclearfactor-B,NF-B)受体活化因子配体,使破骨分化活动无法正常进行19,20。本实验将分离出的不同时期PDLSCs分别与NK细胞进行共培养,对NK细胞的IF
13、N-表达进行检测,结果提示吸收中期组(B)基因及蛋白表达明显低于其他各组,乳牙PDLSCs通过对NK细胞发挥免疫抑制作用抑制其IFN-的分泌,从而影响破骨分化。本实验对NK细胞抑制效果最强的B组进行干预,使用TGF-这一间充质来源干细胞常见的免疫抑制因子对NK细胞进行抑制,结果显示,在加入外源性TGF-后,共培养体系中IFN-的表达明显下降。在加入外源性IL-2后,共培养体系中IFN-的表达相比于TGF-组明显升高,结果有统计学意义(P0.05)。进一步提示TGF-可能在乳牙PDLSCs对NK细胞的免疫抑制中发挥重要作用,影响破骨分化。综上所述,本实验创新性地将乳牙PDLSCs的免疫调控能力与
14、乳牙生理性根吸收联系在了一起,证实了在乳牙生理性根吸收过程中乳牙PDLSCs通过TGF-等细胞因子对NK细胞发挥免疫抑制作用,从而影响破骨分化进程。为乳牙生理性根吸收以及乳恒牙替换的相关机制的研究提供理论依据,也为临床上对于相关疾病的治疗与预防提供了新的思路。参考文献：3汪璐璐,袁帅,王小竞,等.生理性根吸收过程中7nAChR调节破骨细胞分化能力的研究J.实用口腔医学杂志,2017,33(2):198-202.赵辛,杨宽,王子瑞,韩欣欣,汪璐璐,王小竞.根吸收不同时期乳牙牙周膜干细胞通过NK细胞进行免疫调节作用的研究J.口腔医学,2020,40(06):517-520+575.基金:国家自然科学基金(81670988,81800924);陕西省自然科学基金(2019JQ-699)
