精选优质文档-----倾情为你奉上实验二十 感受态细胞的制备及外源基因导入[原理] 转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用R-、M-符号表示受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、CaCl2、MgCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞在一定条件下，将带有外源DNA的载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体（transformant）即带有异源DNA分子的受体细胞 本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用MgCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC19质粒共保温，实现转化pUC19具抗氨苄青霉素的特性即Ampr，将转化后的全部受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
[试剂]1. 1、E.coli DH5α受体菌：R-、M-、Amps2. pUC19质粒3. 5×LB培养基4. 100μg/ml氨苄青霉素5. 含氨苄青霉素的LB平板培养基6. TSS 将10%PEG8 000、5%DMSO、20mmol/L MgSO4，各成分溶于100ml LB培养液中，过滤除菌7. 含20mmol/L葡萄糖的1×LB[器材]1. 恒温摇床2. 电热恒温培养箱3. 无菌操作超净台4. 电热恒温水浴箱5. 紫外分光光度计6. 离心机7. 塑料离心管8. 移液器[操作步骤]1.大肠杆菌感受态细胞的制备（1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3~5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期2）取50μl该菌悬液接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡1~2h， 当培养液开始出现混浊，停止培养3）将1ml细菌加入1个1.5ml塑料离心管中，12 000rpm离心2min沉淀细菌，弃去上清4）将细胞重悬于100μl TSS缓冲液中2.细胞转化（1）在上述细胞悬液中，加入pUC19质粒DNA（含量不超过50ng）此管为转化实验组。
其他管按下表进行N0.质粒DNA/μl（pUC19）感受态细胞/μl无菌水/μl1×TSS/μl样品2100对照11002对照22100（2）将各样品轻轻摇匀，冰上放置10min3）加0.9ml含20mmol/L葡萄糖的TSS溶液，于37℃振荡培养1h5000r/min离心5min，弃去900μl，将沉淀混匀4）将细胞悬液铺布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上平板于37℃孵箱正放30min，然后倒置5）平板于37℃孵箱过夜6）次日观察菌落生长情况，筛选专心---专注---专业。
