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1、 PCR技术 侯云鹏 2013.11.101.PCR概述2.PCR反应的原理和步骤3.PCR的反应动力学4.PCR反应体系的主要成分和作用5.PCR的反应条件控制6.PCR反应的特点7.防止PCR错误扩增的措施8.PCR常见问题及解决办法9.常规PCR技术及几类PCR新技术一、聚合酶链式反应（PCR）概述（一）概念 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaciton, PCR)，即PCR技术，是近年来发展起来的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性-退火-延伸三
2、个基本反应步骤构成：二、PCR反应的原理和步骤 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；3、引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成
3、为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的片段富集106109倍。所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 变性（94度）引物退火（55度）延伸（72度）DNA聚合酶dNTP变性退火引物经2530次循环，目的DNA增加106-9PCR反应过程示意图Y = Y0 * (1+X)nY:扩增拷贝数量Y0:起始模板数量X：扩增效率n:扩增循环数 PCR 理论方程三、PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增
4、的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期。四、PCR反应体系的主要成分和作用lDNA聚合酶l模板l引物ldNTPl缓冲体系（一）DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶来源于嗜热水生菌的重组体，与一般的聚合酶所不同的是在高温状态仍具有活性。 可分为两大类： 1、具有校正功能的（有35核酸酶活性） 比如：Vent,pfu,pwo等 2、不具有校正功能的 （无3 5核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶（二）模板 核酸模板的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。一般临床检测标本，
5、可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 （三）引物 引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 设计引物应遵循以下原则： 1、引物长度一般15-30个bp，常用为20bp左右。引物过短过长都会使特异性降低。 2、引物扩增跨度以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 3、引物碱基G+C含
6、量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。碱基随机分布，避免5个以上的相同核苷酸的成串排列。 4、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 5、引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 6、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 7、引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成
7、二聚体的机会。 （四）dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。（五）PCR反应缓冲液组成：50mM KCl 10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2 Mg2+是Taq酶活性所必需的金属离子。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物
8、减少。（六）PCR反应标准体系五、PCR的反应条件控制（一）PCR反应的温度和时间控制 1、变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。 2、退火(复性)温度与时间 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm值-(510) 在Tm值允许范围内，选择较高
9、的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。 3、延伸温度与时间： PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。（二） PCR反应的循环次数控制 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓
10、度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。六、PCR反应的特点 1、特异性强 PCR反应的特异性决定因素为引物与模板DNA特异正确的结合、碱基配对原则、TqDNA聚合酶合成反应的正确度、靶基因的特异性与保守性。 2、灵敏度高 PCR产物的生成量是以指数方式增加的。 3、简便快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性、退火、延伸反应，一般在24h完成扩增反应。 4、对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总DNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、
11、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。1、隔离操作、戴不受污染的手套2、试剂的配制、分装和保存3、开盖前先离心，小心开盖和上盖。4、加样时最后加模板DNA5、设立对照实验6、注意其他操作过程中可能造成的污染七、防止PCR错误扩增的措施八、PCR常见问题及解决办法 （一）扩增不出特异性带 1、原因 （1）引物设计有问题（引物位置错误，引物之间太强的相互作用） （2）反应体系有问题 （3）退火温度太高 2、解决办法 （1）确认引物正确性 （2）用保证能扩增出来的引物验证反应体系 （3）采用梯度PCR功能，寻找最适合的退火温度 （二）扩增带很弱 1、原因 （1）反应体系效率低 （2）退火温度太高
12、 （3）很多非特异性扩增 （4）大量引物二聚物的形成 2、解决办法 （1）用已确认的引物验证 （2）采用梯度PCR功能寻最适的退火温度 （3）采用定量PCR的熔点曲线功能分析，提高退火温度，改变反应体系的PH值 （三）非特异性扩增带很多 1、原因 （1）退火温度太低 （2）反应体系有问题 2、解决办法 （1）采用梯度PCR功能寻找最佳反应温度 （2）更换反应体系 （四）引物二聚物太多 1、原因 （1）引物设计有问题 （2）反应体系有问题 （3）退火温度太低 2、解决办法 （1）重新设计引物 （2）调整和更换反应体系 （3）用梯度PCR寻找最佳的退火温度 （五）结果的重现性差 1、原因 反应体系
13、发生了变化 2、解决办法 用荧光定量PCR仪熔点曲线功能分析PCR的结果，看非特异性产物和引物二聚物 九、常规PCR技术及几类PCR新技术温度梯度PCR 不对称PCR热启动PCR 原位PCRTouch-down PCR 连接酶链反应RT-PCR RACE-PCR荧光定量PCR AFLP兼并引物PCR 巢氏PC免疫-PCR(immuno-PCR) 反向PCRMSP甲基化特异 PCR（一）温度梯度PCR 1、概念： 通过对复性温度比引物的Tm值低2-10的范围内进行系列PCR预实验来对复性条件进行优化. 温度梯度温度梯度PCRPCR温度梯度曲线Thermal Image of 45-65C Gra
14、dientacross a PTC-200 with a 96-well Alpha温度梯度PCR优化复性温度 48C68CUnoptimized Annealing temperature 50COptimizedAnnealing Temperature 62.6CGradient optimization of 12 different temperatures across the block, tested between 48C and 68C （二）热启动PCR 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72，聚
15、合酶在室温仍然有活性。因此，在PCR反应试剂配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。手动热启动法管底：DNA、预冷buffer、dNTP和dH2O 管壁：引物预热：80加Taq酶，离心，开始PCR循环。专用热启动酶法抗体介导的抑制DNA聚合酶法化学阻断DNA聚合酶法其他DNA聚合酶抑制剂法 （三）Touch-down PCR1、概念： Touch-
16、down PCR又称降落PCR。即选定一个温度范围，如50-35，每降1-2进行1-2个循环，然后在50度下进行15个循环。2、原理： 随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。3、选择初始复性温度的原则： 起始复性温度应该比引物的Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度。4、Touch-down PCR的应用范围 模板DNA浓度较低; 引物简并程度高或特异性低; RT-PCR时使用oligo-dT。（四）RT-PCR1、概念： RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以RNA为模板，联合逆转录反应（reverse transcription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。2、RNA扩增包括两个步骤：（1）在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA（2）加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNADouble strand cDNAAAAAATTTTTRT
