三液相色谱应用技术-201102讲义教材

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1、单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式1戴安中国HPLC用户培训2011年美国戴 安 公 司美国戴 安 公 司美国戴 安 公 司美国戴 安 公 司戴安中国有限公司单击此处编辑母版标题样式单击此处编辑母版副标题样式2 液相色谱应用技术 戴安中国有限公司 提纲:1. HPLC的广泛应用2.色谱柱子的选择性和应用3.色谱柱的使用和维护保养4.液相色谱仪系统清洗HPLC的广泛应用 HPLC特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析并且可以做制备 在医药、食品、农业、生命科学、化工、环保等领域都有着广泛的应用潜力。HPLC的应用领域在食品研究中的分析应用

2、食品中的天然成分类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇碳水化合物脂肪酸和有机酸蛋白、肽、氨基酸食品添加剂酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂抗氧化剂、防腐剂色素维生素污染物霉菌（黄曲霉毒素农药残留和兽药残留多环芳烃（PAHS和亚硝酸HPLC的应用领域 在医药研究中分析应用 药物分析有USP、BP、CP等标准 常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心血管药、磺胺类消炎药等。甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等。抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙等)、萜类手性药物研究中的

3、应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉胺毒性小，L-异构体毒性很强)医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。v 在兽药研究中分析应用HPLC的应用领域 在生物化学和生物工程中的应用 氨基酸、多肽合成和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（儿茶酚胺类) 在精细化工分析中的应用 醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品HPLC的应用领域化妆品行业要控制和分析： 防腐剂、防晒剂、性激素以及维生素等；在公安、刑警破案工作需要 投毒药物、毒品分析等在环境污染分析中的应用废气、废水、废渣

4、中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、 酚类、胺类和二恶瑛的检测 在无机离子分析中应用饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析 二.色谱柱的选择和应用非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的C18柱，PH范围2-9（12）强极性化合物一般采用离子交换柱糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPC有专用柱正相柱-硅胶柱,-CN氰基柱,-NH2氨基柱戴安新型柱：PA,PA II,WAX,WCX,LILIC_1,Trinity选择柱子的重要性不同的分析对象选择不同的柱子不同公司有不同品牌和不同种类填料的柱子HPLC色谱柱子品牌杂种类多C18柱子填料末端封尾的重要性 键合相色

5、谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的70-80%优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响缺点 pH值不能小于2或大于8 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同0.02.55.07.510.012.515.017.520.0-10.00.010.020.030.040.050.0RI_1RIUmin2112354678HPLC测定糖正相氨基柱,示差检测Analytical column: Ultimate XB-NH2, 4.6 *250 mm *5 m at 30 oC Mobile Phase

6、: ACN/H2O (V/V，65/35) Flow: 1.0 mL/min Detection: RI at 30 oC Peaks: Conc.(mg/mL) 1: 木糖 2.0 2: 果糖 2.0 3: 葡萄糖 2.0 4: 蔗糖 2.0 5: 麦芽糖 2.0 6: 乳糖 2.0 7: 麦芽三糖 2.0 8: 麦芽四糖 2.0 Re-mix the mobile phases can ensure the flat baseline!HILIC柱与CAD检测器分析糖类化合物14LC ：Ultimate 3000 column: HILIC 5um 4.6x250mmFlow: 1.0 m

7、L/minDetection: CAD ultra 30CMP: ACN : H2O = 70:30核糖半乳糖样品：1.门东氨酸(Asp) 2.丝氨酸(Ser) 3.谷氨酸 (Glu) 4.甘氨酸 (Gly) 5.组氨酸 (His) 6.氨(NH3) 7.精氨酸 (Arg) 8.苏氨酸 (Thr) 9.丙氨酸 (Ala) 10.脯氨酸 (Pro) 11.光氨酸 (Cys) 12.酪氨酸 (Tyr) 13.缬氨酸(Val) 14.蛋氨酸(Met) 15.赖氨酸(Lys) 16.异亮氨酸(ILeu) 17亮氨酸(Leu) 18 .苯丙氨酸(Phe)分析条件：DIONEX-U-3000 HPLC样品

8、：:20ul 戴安C18柱应用-17种氨基酸分析样品：1.门东氨酸(Asp) 2.丝氨酸(Ser) 3.谷氨酸 (Glu) 4.甘氨酸 (Gly) 5.组氨酸 (His) 6.氨(NH3) 7.精氨酸 (Arg) 8.苏氨酸 (Thr) 9.丙氨酸 (Ala) 10.脯氨酸 (Pro) 11.光氨酸 (Cys) 12.酪氨酸 (Tyr) 13.缬氨酸(Val) 14.蛋氨酸(Met) 15.赖氨酸(Lys) 16.异亮氨酸(ILeu) 17亮氨酸(Leu) 18 .苯丙氨酸(Phe)17种氨基酸标样实时记录色谱图 （虚线为流动相梯度变化曲线） 戴安C18柱应用9种防腐剂同时分析 Peaks:1

9、. 溴硝醇2. 苯甲醇3. 对羟基苯甲酸甲酯4. 苯甲酸5. 对羟基苯甲酸乙酯6. 对羟基苯甲酸异丙酯7. 对羟基苯甲酸丙酯8. 对羟基苯甲酸异丁酯9. 对羟基苯甲酸丁酯 Column: Acclaim C18, 5 m, 4.6 x 250 mmMPA:MeOHMPB: ACNMPC: 50 mM KH2PO4, pH 3.5Temperature: 30 CFlow Rate: 1.1 mL/minInj. Volume:10 LDetection:UV, 254nmMethod: A : B : C = 40 : 15 : 45mAU0.05.010.015.020.025.0-5.02

10、0.040.0min213456789饮料中防腐剂分析戴安Acclaim C18柱-250 *4.6*5u 1ml/min (90/10缓冲盐和甲醇) 饮料中防腐剂分析ZorbaxC18-150*3.0*5u,0,5ml/min (93/7缓冲盐和甲醇) 13种防晒剂的测定200.05.010.015.020.025.030.035.040.0-20100200300400500mAUmin123456789101112131.苯基苯丙咪唑磺酸2.二苯酮-4/二苯酮-53.二苯酮-34.p-甲氧基肉桂酸异戊酯5.甲基苄亚基樟脑6.PABA*乙基己酯（*对氨基苯甲酸 ）7.奥克立林8.p-甲氧基

11、肉桂酸乙基己酯9.水杨酸乙基己酯10.胡莫柳酯11.乙基己基三嗪酮12.亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基13.双-乙基己氧苯酚甲氧苯基三嗪Column: Acclaim C18, 5 m, 4.6 x 250 mmMPA:MeOHMPB: THFMPC: Water(每300ml水中含0.2ml 高氯酸)Temperature: 30 CFlow Rate: 1.0 mL/minInj. Volume:10 LDetection:UV, 311nmTime (min) B% C% 0 45 30 13.0 45 30 20.0 53 15 27.0 50 10 40.0 50 10色谱条件:戴安

12、公司Summit HPLC,荧光检测器+Pickering Labs公司的柱后衍生仪荧光检测:EX330nm,EM465nm流动相:水/乙腈梯度洗脱,0.8ml/min柱子:C18柱衍生试剂流速:0.3ml/min反应器1:温度100 CC,0.5ml/min反应器2:环境温度, 0.1ml/min氨基甲酸酯杀虫剂柱后衍生荧光检测Peak No. Name 1 VB1 2 VC 3 VB3 4 VB6 5 泛酸钙 6 VB12 7 叶酸 8 VB2 9 生物素 10 VK3 11 VA 12 VE 13 VD2 14 VD3u 超高柱性能: 14种水溶性和脂溶性维生素同时分离，可完全兼容100

13、%水相和 100%有机相u 超高仪器性能: 一次分析过程中可同时改变流动相比例，流速和检测波长0.05.010.015.020.025.030.0-20255075100125160VB1,2,3,5,6,12,bio,fol,VC,VA,VD2,VD3,VE,VK3UV_VIS_1mAUmin1234567891011121314WVL:250 nmWvl = 280, AzWvl = 210, AzWvl = 360, AzWvl = 270, AzWvl = 210, AzWvl = 325, AzWvl = 295, AzWvl = 264, AzFlow: 1.000 ml/min2

14、.000ACN: 0.0 %46.0100.00.025% TFA in H2O: 100.0 %54.00.0MeOH: 0.0 %戴安PA2（C18）柱应用230.05.010.015.020.025.030.035.0-2050100150200250300mAUmin12344种雌性激素的测定1. 雌三醇2. 雌酮3. 雌二醇4. 己烯雌酚Column: Acclaim PA II, 3 m, 2.1 x 150 mmMPA:MeOHMPB: WaterTemperature: 30 CFlow Rate: 0.3 mL/minInj. Volume:1 LDetection:UV,

15、204nmIsocratic: A : B = 60 : 40戴安PA柱应用25戴安公司 Acclaim 系列色谱柱及其研发历史除了完善常规反相色谱柱外；近年的主要的研发精力放在了混合基质的色谱柱上使用混合基质色谱柱益处 不同类型物质同时分离 可调整选择性 简化流动相Acclaim PolarAdvantage (PA)Acclaim 300 C18 Acclaim 120 C18Acclaim 120 C82000 Acclaim SurfactantAcclaim PolarAdvantage II (PA2)Acclaim Organic Acid (OA) Acclaim Explos

16、ives E1Acclaim Explosives E2Acclaim Mixed-Mode HILIC (HPLC2007)Acclaim Mixed-Mode WAX (PittCon2007)(HPLC2003)(HPLC2002)(PittCon2001)(PittCon2005)(PittCon2004)(PittCon2006)20012002200320042005200620072008Acclaim 2.2 m RSLC (HPLC2008)Acclaim Mixed-Mode WCX (PittCon2008)20092010We started here Acclaim Trinity P1 (PittCon2009)More Acclaim 2.2 m RSLC小分子分析面临的挑战RP 柱 (如C18) 用途最广泛,但： 存在二级作用。在中性淋洗液条件下，碱性化合物拖尾 对高极性（亲水性）化合物保留很弱 选择性有限RP柱+ 离子对试剂 分离亲水性带电化合物 平衡时间长 使用专用柱 流动相复杂 (MS 不兼容)IEX 柱-分离带电化合物 疏水性差，限制了使用HIL