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1、实验十四 碱性磷酸酶米氏常数的测定一、目的要求1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km和Vm值。二、原理酶促反应v-S曲线vS推导出米氏方程为：其中S为底物浓度；v为初速度；Vm为最大反应速度；Km为米氏常数1/v1/Vm-1/Km1/S本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pNPP)水解的Km和Vm.反应式：pNPP+H2OpNP+HPO42-无色黄色可通过分光光度法测定产物pNP的含量，求出反应速度v。三、试剂与器材试剂：0.5mol/mLpNP、10mmol/LpNPP、20
2、mmol/LMgCl2、0.1mol/L碳酸钠碳酸氢钠pH10.1缓冲液、0.2mol/LNaOH、6 g/mL碱性磷酸酶酶液器材：恒温水浴锅、722分光光度计四、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作（不做） 取5支试管编号,0号一支,17号各二支,按下表操作：管号0123456pNP含量(mol)00.050.100.150.200.250.300.5mol/mLpNP(mL)00.10.20.30.40.50.6H2O(mL)0.80.70.60.50.40.30.2Na2CO3-NaHCO3(mL)各管加入1.0mL20mmol/LMgCl2(mL)各管加入0.2mL0.2mol/LN
3、aOH(mL)各管加入2.0mLOD405nm以对硝基苯酚的绝对量(mol数)为横坐标，OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出pNP的克分子消光系数()值。(二）测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。No.12345底物终浓度S(mM)0.50.751.01.5310mmol/LpNPP（mL）0.10.150.20.30.6蒸馏水（mL）0.60.550.50.40.1碳酸盐缓冲液（mL）各加1.0mL20mmol/LMgCl2（mL）各加0.2mL预热混匀，37，5分钟酶液（mL）测测定管各加0.1mL酶液反应时间 37，精确反应10分钟0.2mol/LNa
4、OH（mL）各加2mL酶液（mL）空白管各补加0.1mL酶液OD405分别以01-05调零点，测定对应样品管OD405。（三）数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的OD值(OD405nm)。从对硝基苯酚标准曲线上查出OD405nm相当于产物对硝基苯酚的含量，计算出各种底物浓度下的初速度vo（单位以molL-1min-1表示），取倒数1/v填入表内。以1/v对1/S作图，求出酶催化pNPP水解的米氏常数Km和最大反应速度Vm。五、注意事项1.取液量一定要准确（移液管或取液器的使用）。2.反应时间一定要精确。3.加酶前后一定要将试剂混匀。4.空白对照一定要先加NaOH，后加酶。5.测定OD405时要以各自的空白调零点。6.不要直接把测定完的样品溶液倒掉，而要倒回原试管。7.比色杯的使用8.底物pNPP要按需取用。9.如果测定值太小或者太大超出量程，要适当调整加酶的体积或者酶浓度重新进行实验。六、思考题(1)试说明米氏常数Km的物理意义和生物学意义。(2)为什么说米氏常数Km是酶的一个特征常数而Vm则不是？
