《EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建》由会员分享，可在线阅读，更多相关《EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、EBVLMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建【摘要】目的构建EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白 2A (LMP2A)编码基因和即刻早期基因(BZLF1)融合基因的重 组腺病毒表达载体。方法逆转录？聚合酶链反应分别获得 LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA，采用剪接式重叠延伸(SOE)技术将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3的DNA序 列进行连接，构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克 隆到p AdTrack?CM V质粒上，在原核细胞BJ 5183中完成穿 梭质粒与骨架质粒pA dEas y?l的同源重组，构建融合基因 Z 2A真核表达载体pA d?Z2Ao经抗生素培
2、养板筛选重组体 然后转染293细胞，获得复制缺陷型重组腺病毒vAd?Z2Ao 结果重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切，电泳后可 观察到长31kb和k b两条DNA条带，测序鉴定结果表明序 列正确；从感染重组腺病毒vAd ?Z2A的293细胞中检测到 融合基因Z2A的表达。结论本研究成功地构建了 EBVLMP2A 和BZLF1融合基因Z 2A重组腺病毒表达载体，为进一步研 究Z2A的功能提供了实验基础。【关键词】疱疹病毒4型人潜伏膜蛋白2A基因BZLF1 基因融合表达载体ABSTRA CT Objectiv eT oconstruc t Z2Arecombi nantadenovi rusve
3、ctoran dstudythee f fectofZ2A expression onE BV?asso ciat edtumo r. Met hodsB othLMP 2Aan dBZLFlc DNA wereclon ed fromB95?8 c elllinebyR T?PCR, andth efusiongene (LMP2A?lin k er?BZLFl) wa sconstru cte dbyusin gapo lypept ideli nker (Gly4Se r)3. Z2Avect orp Ad?Z2Awa sc onstructe d byingtheZ2 Afusiong
4、ene intopAd?eas yleukaryot i cexpressi ng plasmid, 293 cellswe retr ansfec tedwi thpAd ?Z2A.R esul tsTheel ect rophores is ofEcoRVan d Bgl II digest edproductss howedtwoDNA fragmentsw h ichwere31 kb andkb,re spe ctively .The result ofDNA seque ncingd emon strated tha tZ2Aha.de di ntheexpec t edsitea
5、ndt heionsequen cewasexactl ycorrect. T h eresultss ho wedthatZ 2Ap ositive reco mbinan taden oviru scould expr essZ2A. Con clusionZ 2A recombina n tadenovirusvectorhasb eenconstruc tedandcanb e usedforfu rt herresea rch .KE YWORD S her pesvir us4, human:L MP2 A;gene, B ZL FI; genefu s ion; expres s
6、ionvectorEB病毒（EBV）是具有B淋巴细胞嗜性的疱疹病毒，为 重要的DNA致瘤病毒，与多种人类恶性肿瘤，如B urkit t淋 巴瘤、鼻咽癌（NP C）、何杰金病、免疫缺陷病人的B淋巴 细胞瘤、胃癌及肝癌等的发生有关。EBV对宿主细胞的感染 有潜伏感染和裂解期感染两种类型。研究表明，EBV阳性癌 组织中主要以潜伏感染的形式存在，EBV基因组存在于几乎 所有的癌细胞，因此可以EBV基因组或编码产物为靶点对E BV相关肿瘤进行特异性治疗13 。本研宄拟将EBV潜伏 膜蛋白2A(LMP2 A )编码基因和即刻早期基因(BZLF1)进行融 合，进而构建融合基因的重组腺病毒表达载体，为进一步
7、探讨融合基因表达对EBV阳性肿瘤细胞增殖的影响提供实 验基础。现将结果报告如下。1材料和方法主要试剂、质粒和细胞株本文 T4DNA 连接酶、X DNA /HindUL DL20 OOMarker、 限制性内切酶EcoRV、B gill均购自宝生物工程(大连) 有限公司；DN A转染试剂盒lipof ectam ine20购自I nvitrog en公司；质粒提取试剂盒为Promega公司产品。携 带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrack?CMV，E1区和 E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdeasy ?1，大 肠杆菌BJ5 183和DH1OB以及人胚肾2 93细胞由中国疾病控
8、制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。EB V 阳性B95?8细胞系日本鸟取大学医学部生体情报学教室西 连寺刚教授惠赠。引物设计根据LMP2A和B ZL F1开放读码框序列4，5，DNAStar软件设计扩增EBVLM P2A和B ZLF1基因的特异性引物， 并在LM P2A上游引物的5端引入Bgl II酶切位点和保护性 碱基GGC,下游引物3端删除终止密码TAA，引入linke r; BZLF1下游引物5端引入EcoR V酶切位点和保护性碱基 GC，上游引物 3Z 端引入 1 inkero linke r(Gly 4Ser)3 为编码1 5个氨基酸组成的疏水性多肽的DNA序列，序列为
9、5 ?GGT G GCGGTGGAAG CGGCGGTGGCG GA9AGCGGCGG TGGCGGCAGC ?3，。LMP2A 上游引物 P1 序列为. 5，？G GCAGATC TATG GGGTCC CTAG?AAATG GTG?3,下游重叠引物 P2 序列为：5 ?GCT?GC CG CCACCGCCG C TTCCGCCACC GCCGCTTC?CA CCGCCACCTAC AGTGTTGCGA T ATGGGGT?3 。BZLF1上游重叠引物P3序列为：57 ?GGTGG CGGTGG AAGC GGCGGTG GCG GAAGCGGC GG TG?GCGG CAGCATGATGG
10、 ACCCAAACTCG AC?3,下游引物P 4 序列为：5 ?G CG ATATCTTA GAA AT?TTAA GAGA TCCTCG TG?3。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 (PA GE纯化)，扩增产物LMP2A长为15 4 5bp, BZLF1长为 791bp,融合基因长为2291bp。LMP2A和BZLF1基因的扩增采用TRIz ol 步法提取B95?8细胞总R NA，参照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA用作PC R反应模板。 PCR反应体系容量为25 P L，包括10 X buffer u L,MgC12mmol /L, dNTPmmo 1 /L,上下游引物各
11、mm ol/L，Taq 1U，cDNA2uL，无菌去离子水补至2 5uL。反应条件为： 94C预变性5min ;然后 94C、60s，55C、60s，7 2C、 90s，扩增3 5个循环；最后72C延伸lOmin。PCR扩增产物 于含溴化乙锭(mg/L)的8g/L琼脂糖凝胶中电泳30 mi n， 紫外线透射仪下观察电泳结果。目的基因的T A克隆和测序分别将LMP 2A和BZLF1的P CR扩增产物插入高效克隆 载体pMD18?T，转化JM109感受态细菌中，在含有X?g al 和IPTG的氨青霉素LB平板上进行蓝白斑选择。TA?LM P2A 和TA?BZL F1阳性克隆由上海生物工程技术有限公
12、司进行 DNA序列测定，测序结果与Gen Ban k中EBV标准株LM P2A和BZLF1编码基因序列进行比对。融合基因Z2A的构建以TA7LMP2A和TA?BZLF1质粒为模板进行PCR扩增，结 果分别获得带有link er互补序列的LMP2 A和BZL F1片段。 将LMP2 A和BZLF1的PC R产物行琼脂糖凝胶电泳后回收纯 化，以其为模板在编码(Gly4 Ser)3多肽的DNA的片段连接 下，根据重叠延伸原理进行基因重组7，获得Z2A融合基 因片段。将纯化后的Z2 A融合基因片段插入TA载体，提取 质粒DNA分别进行酶切鉴定和DNA序列分析。重组腺病毒P Ad ?Z2A的构建融合基因
13、Z2A和腺病毒穿梭质粒pAd?CMV分别用EcoR V和B g III进行双酶切，连接后转化DH5a ,培养后挑取 白色单菌落，小量提取质粒DNA进行pAdT rack?CMV?Z2 A 重组体的PCR筛选及酶切鉴定。重组pA d Track?CMV?Z2A质粒用限制性核酸内切酶Pme I酶切线性化，并用碱性磷酸酶将线性化质粒去磷酸化， 与1 uL(ug)pAdEasy?l质粒同时转化感受态BJ51 83，将 转化的BJ5 183感受态菌液涂布于含35mg/L卡那霉素的LB 平板，37 C培养1620h。挑取较小菌落，在含卡那霉素 (35mg/L)的LB液体培养基中37 C振摇培养1216 h
14、， 碱裂解法小量提取质粒DNA，用限制性内切酶Pac I酶切后 电泳进行鉴定。如果r ighta rm和le ftarm同源重组，重 组质粒用Pa c I酶切可产生kb左右的D NA的片段；如果r i ghtarm与ori同源重组，酶切产物大小约kb,阳性质粒 命名为pAd?Z2A。重组腺病毒的制备在25c m2培养瓶中接种293细胞，当细胞生长至约为 5 0%7 0%汇合时弃去培养基，按照脂质体转染试剂盒 (lipofe c tamine2000 )使用说明将带有Z2A融合基因的重 组质粒转染293细胞。在观察到细胞荧光出现57d后收获 细胞，反复冻融3次裂解细胞，离心除去细胞碎片，取上清
15、再次接种29 3细胞，如此重复34次。R T?PCR 检测 Z 2A mRNA用重组腺病毒vAd?Z2A感染293细胞，3d后收集细胞， 1000r/m in离心lOmin，弃上清。采用TRI zol 步法提取 细胞总RNA，将所获得R NA加入D Nase I消化处理可能污 染的D NA后进行RT ?PC R检测。取5 u L用D Nase I消化处 理的RNA直接作为模板进行PCR作为对照，PC R产物于琼脂 糖凝胶中电泳检测鉴定。2结果目的基因的RT?PCR扩增采用RT ?PCR技术自EBV阳性B95?8细胞扩增LMP2A和 BZLF1编码序列cD NA，PCR产物长分别为1545bp和
16、791 bp， 结果见图1。序列分析显示LMP2A和B ZLF1编码序列cD N A 与GenBank中标准毒株相应序列一致。图1目的基因的PCR扩增产物：PCRMa rke rDL2000;：阴性对照；、：BZLF1PCR产物；：LMP2APCR产物融合基因PCR产物电泳和测序结果融合基因Z2AP CR扩增产物长度为2 291bp，电泳结果与DNA准分子质量参照物DL150 00比较，与预测结果一 致，见图2。其测序结果也与LMP2A、BZL F1以及linker 的核苷酸序列比较一致。图2融合基因的PCR扩增产物：Z2A融合基因PC R产物；、：LM P2APCR 产物；：PCRMarkerDL2000;：X DNA/HindIII腺病毒质粒穿梭载体pAdTrack?CM V?Z2A的鉴定融合
