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1、木蹄层孔菌Lac的酶学性质研究 摘要 本文对木蹄层孔菌漆酶的酶学性质进行了研究。结果如下：以 ABTS 作为底物，酶反应的最适 温度为 50 C；最适 pH 值为 3：在 40 C 以下保持酶活力相对稳定，5(TC 酶活性基本全部丧失；在 pH 值3.54 范围内保持相对较高的酶活力。lOniM/L的 Ba2+ Ca2 Co Fe3 Na K*这六个金 属离子对漆酶酶活有较强的抑制作用，其中 Fe+的抑制作用最强，而 Mg?*, C+对两种漆酶均有激 活作用。以 ABTS 为底物时，漆酶的 Km值为 0.05mn】ol/L。 关键词：木蹄层孔菌，漆酶，酶学性质ENZYMATIC PROPERT
2、IES STUDY OF TINDER FUNGUS LACCASE ABSTRACT In this paper, the tinder fungus enzymology properties of laccase were studied. Results are as follows: to ABTS as substrate, the enzyme reaction of the optimum temperature is 50 C; The optimal pH value is 3; Enzyme activity stabilization are under 40 C, b
3、asic all lose enzyme activity under 50 C; Within the scope of the pH value of 3.5 4 remained relatively high enzyme activity. 10 mm/L Co*, Ca 二 Ba&, Fe*, Na*, K+ the six metal ions on laccase enzyme activity had a stronger inhibitory effect, one of the strongest inhibitory effect of Fe3+, and Mg , C
4、u2 effect on two kinds of laccase are activated. ABTS as substrates, laccase Km value tendency for 0.05 L. Key words： tinder fungus, laccase, enzymatic properties第 1 章绪论 . 1 1.1木蹄层孔菌国内外研究进展 . 1 1.2漆酶国内外研究进展 . 1 1.2. 1 漆酶理化性质 . 2 1.2.2漆酶的应用 . 3 第 2 章材料和方法 . 4 2. 1 实验材料与仪器 . 4 2. 1. 1 菌种 . 4 2. 1.2实验材
5、料、试剂 . 4 2. 1. 3 实验仪器 . 5 2. 2 实验方法 . 5 2.2. 1 木蹄层孔菌的培养 . 5 2.2.2粗酶液的制备 . 5 2.2.3漆酶酶学性质 . 6 2.2.5数据统计和分析 . 7 第 3 章结果与分析 . 8 3. 1 最适反应 pH 值及 pH 稳定性 . 8 3. 2 最适温度及热稳定性 . 9 3. 3 金属离子及抑制剂对漆酶活性的影响 . 10 3. 4Km . 10 第 4 章讨论 . 12 致谢 . 13 参考文献 . 14 第1章绪论 1.1木蹄层孔菌国内外研究进展 木蹄层孔菌(Fomes fomentarius(L.:Pr,)Kck.)是一
6、种多孔菌科的高等药用真菌，是世界性分布的 木腐性真菌。它们生长在北美洲及欧洲的桦木属及水青冈属。单一颗树上就可以有多个子实体。 木蹄层孔菌并不能食用，由于其担子果可以阴燃几个小时，故可以用来点火。子实体大至巨大，马 蹄形，无柄。多呈灰色，灰褐、浅褐色至黑色，有一层厚的角质皮壳及明显环带和环梭，边缘钝。 菌管多层，软木栓质，多年生，生于栋、桦、杨、柳、概、榆、水曲柳、梨、李、苹果等阔叶树干 上或木桩上。子实体和菌丝体中都含有许多具有生物活性的物质，代表物质就是木蹄多糖七往往 在生境阴湿或较黑暗的生境出现棒状畸形子实体。分布于我国香港、广东、广西、云南、贵州、河 南、陕西、四川、湖南、湖北、山西、
7、河北、内蒙古、甘肃、吉林、江宁、黑龙江、西藏、新疆等 地区吐 在 18世纪利 19 世纪，木蹄层孔幽曾被用来作为止血的商药，在一些传统的药典中被用来作为 针灸的工具。在中国和亚洲其他许多国家，木蹄子实体水煎服广泛用于治疗食管癌、胃癌、口腔 溃疡、肠胃失调、发炎和各种感冒等疾病伐-气国内外对木蹄的研究结果表明，木蹄具有显著抑制肿 瘤细胞生长、增强机体免疫功能和抗氧化等功效。目前，对木蹄层孔曲的研究主要是对其甲醇、乙 醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醍、正丁醇的提取物的抗肿瘤活性进行研究。有学者对木蹄层孔菌子 实体化学成分做研究表明其含有酚、有机酸、昔类等。研究表明其子实体和菌丝体中都含有许多 具有生物活
8、性的物质，其中的多糖具有抗肿瘤和免疫刺激活性。 1.2漆酶国内外研究进展 漆酶即多酚敏化酶，是一种蓝色多铜氧化酶家族的糖蛋白氧化酶，它利用分子氧作为皱化剂， 氧化木质素中酚型单元成为酚氧游离基，同时还原分子氧生成水。在 ABTS存在时，能氧化木质素 中的非酎型单元，并旦其催化过程不需要 H2O2参与，因此它在催化木质素降解时有一定的优越性叫 漆酶按来源可分为漆树漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶，其中以真菌漆酶为主。在产漆酶的真菌中最至 要的是担子菌中的门腐菌。白腐真菌漆酶通常以多里基因编码的同工酶形式出现，有来源广泛、单 第1 1页共1414页 电子氧化还原电位高、可以催化降解多环芳炷类物质等特点加
9、J。 由于漆酶底物的广泛和人们对漆酶介质的不断研究，漆酶的商业用途也越来越广泛。目前漆酶 的研究主要集中于对漆酶的酶学性质研究，酶活测定，发酵条件研究这方血，已有利用漆酶降解木 材中的木质素、生产酒精和利用漆酶区分吗啡和可卡因的先例七 1.2. 1漆酶理化性质 1. 1 漆酶催化反应机理 漆酶的作用底物具有广泛性，但对氧具有专一性。漆酶催化苯崂类芳香胺等物质的整个催化过 程大致包括：酶分子对底物的作用、电子在酶分子中的传递、氧分子对酶分子的还原。就酚类化合 物和芳香胺类化合物而言，漆酶利用氧分子作为电子受体，从被氧化的底物分子中，通过单电子提 取方式从多酚类化合物的。-位和 P-位的-0H 和
10、芳胺中去除一个 H 原子，形成自山基，该自山基不稳 定，进一步发生聚合或解聚反应，引起重排、二聚、烷基-芳基断裂、节醇氧化、侧链和芳环的断裂 或生成醒等一系列的非酶促反应。在氧的存在下，还原态漆酶被氧化，氧分子被还原为水。 漆酶催化不同类型底物氧化反应的机理主要表现在两方面：一方面是底物自由基中间体的生成。 在这-过程中，漆酶从被氧化的底物分子中提取一个电子，使之形成自山基，该自山基不稳定，可 进一步发生聚合或解聚反应。在。2 存在下，还原态漆酶被氧化，。2 被还原为水。另一方面，漆酶催 化底物氧化和对。2 的还原是通过四个铜离子协同传递电子和价态变化来实现的。漆酶催化 4 个连续 的单电子转
11、移氧化还原性底物，将分子氧还原为水。还原性底物结合于 Tlcu 位点，TICu 从中提取 1 个电子，该电子通过 Cys-His 途径传递到 T2/T3CU 三核中心位点，该位点结合了第二底物分子氧, 接受 TICu 的电子，并传递给氧，使之还原为水。 1.2漆酶底物的专一“性 漆酶的作用底物具有较大的广谱性，初步统计，漆酶催化氧化不同类型的底物己达 250 个，而 且还有增加的趋势，底物结构大致可归纳如下网：酚类及其衍生物：如 2, 6一二甲氧基酚，愈创木 酚等。这一类底物最容易被氧化；芳胺及其衍生物：如邻联茴香胺。这类化合物结构与酚类相似， 比较容易被氧化；短酸及其衍生物：如咖啡酸，阿魏酸
12、等，也可以被氧化；一些人工合成的化合物: 如 ABTS 等非酚类化合物也可以作为漆酶的底物；金属有机化合物：这类底物主要有二茂铁类化合 物；其它化合物:这类底物主要包括苯环上连有轻基、烷氧基、氨基、氯代化合物及多环、稠环化合 物、杂环化合物等。 1.2.2漆酣的应用 漆酶作为一种高效，绿色的催化剂，随肴固定化技术的不断发展，扩大了漆酶的工业应用范围 和前景，固定化酶在废水处理，生物传感器，食品行业方面中有着至要的应用价值。 2. 1 废水处理的应用 造纸工艺中需要去除木质素，传统高温蒸煮去除木质素的纸浆得率低旦污染环境，而漆酶能选 择性地催化木质素降解的这个特性可用于纸浆生产，减少环境污染，杜
13、绝废水。这是漆酶最有前景 的应用形 漆酶还可用作纸浆的生物漂白。漆酶来源广泛、使用方便，降解木质素效率高，固定化后能更 有效的发挥作用。目前，漆酶介导系统己经得到了实际应用 I。 2. 2 食品工业中的应用 在饮料方而的应用：除去啤酒和果汁等饮料原料中的酚，提高啤酒质量和透明度。另外，漆酶 还在食品分子的交联、改善生面 I才 I的性质、增加酱油风味、去除食品异味等工艺中发挥着重要作用。 在食用菌和药用留方面的应用：在食用菌制种过程中加入漆酶制剂能加速木质素的分解，能为 菌丝提供更丰富的养料，加快菌丝吃料，缩短培养时间。利用这种方法培养木耳、香菇等将有益于 节约成本和扩大生产规模气 2. 3 环
14、境保护中的应用 去除氯酚类有机化合物：很多研究表明，漆酶具有转化酚型底物的能力，其中包括氯酚、甲基 酚、甲氧基酚等。在底物聚合过程中，有氯离子从溶液中被释放出来，这表明漆酶具有去除氯酚化 合物毒性的作用。 染料降解：在印染和造纸等工业过程中，大量含有染料的废水释放，成为当今主要的环境问题 之一。白腐菌漆酶具有广泛的底物专-性，可以氧化芳香环化合物，对纺织染料的脱色及降解效果 明显。 2. 4 生物检测中的应用 漆酶在催化过程中消耗氧气，这-过程很容易被转化为电信号而高灵敏地得到检测。在免疫检 测中，漆酶有望替代辣根过氧化物酶成为新的标记酶，因为它有如下几个优点：氧气作为第二底物, 不形成非产物
15、型的酶底复合物；相比于过氧化物酶，漆酶对介质中不同价态的金属离子浓度的敏感 性较低无需特殊的仪器和试剂。同时山于漆酶能够催化多种酚类物质生成酚类化合物，固定化漆酶 电极作为生物传感器在酚类物质的检测中应用广泛叫 第2章材料和方法 2. 1实验材料与仪器 2. 1. 1菌种 木蹄层孔菌（东北林业大学遗传学实验室提供） 2. 1.2实验材料、试剂 马铃薯、葡葡糖、琼脂、麦秋、玉米、木屑、可溶性淀粉、麦芽糖、酵母汁、蛋白月东、牛肉膏、 ABTS（lmM）、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH3）、75%的酒精. 表2-1 微量溶液的配制 药品 含景/L MgSoi 3g MnSoi 0. 5g Nacl 1
16、g FeSoi. 7H?o 0. 1g CacL 0. 1g ZnSoi. 7H20 0. 1g CuSoi 0. 1g Kal（Soi）2. I2H20 1 Omg NaMoOi. 2H20 1 Omg 次氮基三乙酸酯（NTA） 1.5g 表2-2 液体培养基配制 萌品 含量/L 白桦木屑 10g 酒石酸铉 0.2g MgSO4 0.5g CaCl2 0.1g 琥珀酸（二）甲酯 10mM( 1.3ml) 微量元素 70ml 硫胺素（VB1） Img 2. 1. 3实验仪器 紫外可见分光光度计、恒温箱、烘箱、高压湿热灭菌锅、干热鼓风超净台、可调控温度摇床、 冰箱、刀、锅、电磁炉、打孔器、镶子、三角瓶、烧杯、容量瓶、棕色试剂瓶、移液枪、离心管、 高速冷冻离心机、离心机、磁力搅拌器、酸度计。 2. 2实验方法 2. 2. 1木蹄层孔菌的培养 2. 2. 1. 1 PDA 培养基 在烧杯中加入 300ml 蒸俺水，将土豆去皮切成 5mm 的小方块。去除掉虫蛀和坏的，称取 200g 土豆料放入纱布中包好，再讲纱布放入烧杯中，将烧杯置于沸水中煮 30min,拿出烧林，将纱布挤 干，再称取葡萄糖
