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1、基因治疗Gene Therapy许多疾病如遗传性疾病、肿瘤等与人体的基因异常有密切的因果关系。早在DNA 重组技术之前就有人提出将正常基因顺序导入病人体内进行基因水平治疗的设 想。Edward Tatum和Joshua Lederberg在60年低曾提出可利用病毒作为基因 转移的载体。但直到1990年才成功地实现了用基因治疗手段尝试治疗腺若酸脱 氨酶缺乏症(adenosine deaminase deficiency) 到目前为止,己报道的基因 治疗方案已超过百种。有300多病人接受了这种新的治疗方式。基因治疗的对象 不再局限于遗传病，而被扩展到肿瘤和传染病等多种疾病。其发展相半迅速，前 景十
2、分看好，我国学者也在用基因治疗方式治疗血友病方面做了一定工作。目前 己积累了一定的经验和教训，有了一些可遵循的操作程序及可供选择的治疗方 式。但这种新的治疗方式仍有许多环节需要不断改进和提高。一、基因治疗的概念和策略基因治疗(gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因较正或置换致病 基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中，目的基因被导入到靶细胞(target cells)内，他们或与宿主细胞(host cell)染色体整合成为宿主遗传物质的一 部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗 疾病的作用。目前基因治疗的概念了较大的扩展，凡是采用分
3、子生物学的方法和原理，在核酸 水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新 的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展。根据所采用的方 法不同，基因治疗的策略大致可分为以下几种：基因置换(gene replacement):基因置换就是用正常的基因原位替换病变细胞 内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但 目前由于技术原因尚难达到。基因修复(gene correction):基因修复是指将致病基因的突变碱基序列纠正, 而正常部分予以保留。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操 作上要求高，实践中有一定难度。基因修
4、饰(gene augmentation)又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其 它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加 强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种 方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止 经皮冠状动脉成形术诱发的血检形成。基因失活(gene inactivation):利用反义技术能特异地封闭基因表达特性， 抑制一些有害基因的表达，已达到治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或肽 核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用 此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的
5、表达，增加化疗效果。免疫调节（immune adjustment）:将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体 内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素-2导入 肿瘤病人体内，提高病人IL-2的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到 防治肿瘤复发的目的。其它：增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性：采用给予前体药物的方法减少化疗 药物对正常细胞的损用力。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸甘激酶基因，然 后给予病人无毒性GCV药物，由于只有含HSV-TK基因的细胞才能将CGV转化成 有毒的药物。因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。总之，基因治疗的策略较多，不同的方法在实践中各具有
6、优缺点。而基因的治疗 本身也并不局限于遗传病的治疗，现已扩展到肿瘤、病毒性疾病等。基因治疗可 用于疾病的治疗，也可用于疾病的预防。应该指出的是基因治疗并不是万能的， 尚不能取代现有的治疗方法，作为一种新的方法也还有一些需进一步完善的地 方，在实践是应相互结合，取长补短，以取得较好的治疗效果。一些常见疾病的治疗策略见表U表1基因治疗策略遗传性疾病一隐性遗传病用正常基因置换致病基因而达到完全校正一导入正常基因序列以达到暂时性校正一显性遗传病用正常基因置换致病基因而达到完全校正一使有害基因失活而达到暂时性校正（如用反义技术、核酶等）在某些情况下可导入正常基因加以校正（如LDL受体）肿瘤杀伤肿瘤细胞（
7、如利用自杀基因，激活免疫系统及保护正常细胞免受化疗 药物的损伤等）一使癌基因失活（反义技术、核酶）或增加抑癌基因的表达传染病一杀伤传染源（免疫法、自杀基因）一使传染源失活（反义技术、核酶、核酸陷井） 其它疾病一导入药物基因（药物释放）如激素、细胞因子一失活有害基因产物（反义技术、核酶、核酸陷井）杀伤策略如减少特异细胞群二、基因治疗的基本程序基因治疗是在基因工程基础上发展起来的分子生物学技术，它相对于现有其它治 疗方法较为复杂。基因治疗的基本过程包括以下主要方面：（一）目的基因的选择和制备基因治疗的首要问题是选择用于治疗疾病的目的基因。对遗传病而言只要已经研 究清楚某种疾病的发生是由于某个基因的
8、异常所引起的，其野生型基因就可被用 于基因治疗，如用ADA基因治疗ADA缺陷病。但在现在的条件下，仅此是不够的。 可用于基因治疗的基因需满足以下几点：在体内仅有少量的表达就可显著改善症 状；该基因的过高表达不会对机体造成危害。很显然某些激素类基因如与血糖浓 度相关的胰岛素基因目前尚不能用于糖尿病的基因治疗。在抗病毒和病原体的基 因治疗中。所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史和起重要的作用并且该序 列是特异的，如针对HBV的HBeAg或X基因等。肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用 免疫因子基因转入人体，肿瘤细胞内往往存在多种基因异常形式，可采用反义技 术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌
9、基因，抑制肿瘤生簪，所 针对的癌基因或抑癌基因应下该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。在确定欲选目的基因后，就在制备目的基因。正向表达的基因可以是cDNA （complementary DNA）,也可是基因组DNA（genomic DNA）片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚酶链式反应（polymerase chain reaction PCR）等新技术 进行体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用人工合成的 方式制备。（二）基因的转运目前己有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。已使用的 有病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒
10、可感染特异的细胞，在细胞内不 易降解；RNA病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的 基因转运载体。目前己被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒。 疱疹病毒和肝炎病毒等。逆转录病毒用作载体时需进行几步改造：（1）将天然 的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原 则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因，如图1所示。（2）制备辅助 细胞为载体DNA提供其丧失的功能，如图2所示。（3）将载体DNA导入辅助以 产生病毒载体。如图3。（4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表 达，如图4所示。STEP 1INSERTING FOR
11、EIGN DNA INTO THE RETROVIRAL PROVIRUSWild-Type Provirus图 1 Scientists use recombinant DNA techniques to replace the gag, pol, and env genes with one or more foreign genes. The foreign genes can be inserted in several different patterns, in this example, a selectable marker gene (neo) replaces the vi
12、ral gag and pol genes and a human gene replaces the env gene.STEP 2MAKING THE HELPER CELLDesiging the Helper Vius图 2 The helper cell should meet two basic requirements:(1)it should provide functions missing from the the vector virus, and(2)it should not be capable of producing viable virus particles
13、. The crucial element in the development of a successful helper cell is the design of the helper virus. Researchers use recombinant DNA techniques to disable the helper virus in the test tube-one of the most common measures is removal of the Psi fragment. The Psi-deficient helper virus produces all
14、of the normal viral proteins, but cannot package its own RXA because it lacks the appropriate packaging signal. Helper virus DNA is inserted into the genome of the helper cell using chemical techniques.STEP 3PRODUCING THE VECTOR 图 3 Scientists use chemical measures or an infection technique to inser
15、t recombinant vector DNA (including a human gene) into helper cells. Because the vector provirus contains the Psi sequence, the vector RNA genome is automatical ly encapsulated by viral proteins produced by helper virus DNA in the helper cell. The resulting viral particles are released by budding fr
16、om the helper cell membrane. The vector virus is capable of only one infection because it lacks the information needed to make viral proteins.STEP 4INFECTING THE TARGET ELL图 4 Researchers infect target cells (such as human bone marrow cells) with the vector virus in two different ways: they mix them with helper cells producing the virus, or they bathe them in fluid harvested from the he
