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1、质粒DNA提取定量酶切与PCR鉴定实验报告 粒 质粒 DNA 的提取、定量、酶切与 PCR 判定 一、 实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的要领； 2.学习并掌握了解质粒酶切判定的要领； 3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和要领； 4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操纵要领； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用要领。 二、 实验原理 1.PCR(多聚酶链式反响) 在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步调， 在体外（缓冲液中）复制 DNA，使目的 DNA 按 2
2、 n 方法呈指数形式扩增。 PCR 一次循环的具体反响步调为： A.变性：加热反响系统至 95，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐低落溶液温度，使合成引物在低温（3570,一般低于模板 Tm 值的 5左右），与模板 DNA 互补退火形成部分双链。 C.延伸：溶液反响温度升至中温 72，在 Taq 酶作用下，以 dNTP 为原料，引物为复制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒 DNA 的提取与制备 (1).碱裂解法： 染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差别： A.高碱性条件下，染色体 DNA 和质粒 DNA 均变性；
3、B.当以高盐缓冲液调治其 pH 值至中性时，变性的质粒 DNA 复性并生存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2).离心层析柱： A.硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA，而不吸附溶液中的卵白质和多糖等物质； B.通已往卵白液和漂洗液将杂质和其它细菌身分去除； C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。 3.质粒 DNA 的定量阐发（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.种种差别的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA 分对波长
4、 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 卵白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C.A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反响 DNA 的纯度； A260/A280=1.8 DNA 纯净 A260/A2801.8 体现样品中含卵白质（芳香族）或酚类物质 A260/A280>1.8 含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。 4.质粒 DNA 的酶切判定： 限制性内切酶是 DNA 重组操纵历程中所使用的根本东西。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列结合，或是与其四周的特异位点结合，并在结合
5、位点切割双链 DNA。 5.琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的巨细决定于琼脂糖的浓度。 DNA 分子在碱性情况中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：差别的 DNA，分子量巨细及构型差别，电泳时的泳动率就差别，从而分出差别的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比干系). 三、 质料与要领： ： （ 一 ） 实验质料： ： 1.PCR 仪器：PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 质料：菌液【大肠杆菌 DH5a 菌株(pMD19-T 质粒,含目的片段-绿色荧光卵白 GFP)】
6、、无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2. 质粒 DNA 的提取与制备 仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加样枪、离心管 质料：溶液 P1（S1）、溶液 P2 (S2）、溶液 P3（S3）、去卵白液 PE（W1）漂洗液WB（W2）、洗脱液 EB（Eluent)、含 pMD19-T 质粒的大肠杆菌 DH5α 3. 质粒 DNA 的定量（紫外分光光度法） 仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 质料：蒸馏水、质粒 4.质粒 DNA 的酶切判定 仪器：1.5ml 的 EP 管、微量加样枪 质料：无菌水、10×M 酶切
7、缓冲液 Buf R、质粒 DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳 仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统 质料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液 （ 二）实验要领 1. .PCR 2 . . 质粒 DNA 的提取与制备 准备目的 DNA：菌液煮沸 10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液 取 0.2 ml PCR 反响管一只，用微量加样枪按下述顺序分别参加：灭菌去离子水5.5μl、2*Premix Taq12.5μl、引物 1 (10 mol/L) 1μl、引物 2 (10
8、mol/L) 1μl、菌液 5μl 将装有 PCR 反响体系的 PCR 反响管放入 PCR 仪上进行如下操纵： 94预变性5分钟后开始以下循环 循环为9430 秒，5030 秒，72 1 分钟。循环为 30 次 72 5 分钟 4 保温 取 1.5ml 培养物参加 Eppendorf 管中 将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中 13000rpm x 1min，弃上清 将 PCR 反响管置台式离心机中瞬时离心 3 . 质粒 DNA 的定量（紫外分光光度法） 参加 250μl 溶液 S1，吹打，使细菌沉淀疏散，彻底悬浮 参加 250μl 溶液 S2，颠倒 46 次
9、混匀（不要剧烈振荡），直到溶液变得清亮 参加 350μl 溶液 S3，立即温和混匀 68 次。13000rpm 离心 10min，小心取上清液（500-800μl ） 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液参加吸附柱中，13000rpm 离心 3min，弃滤液 参加 500μl 去卵白液(W1)，13000rpm 离心 1min，弃滤液 向吸附柱中参加 700μl 漂洗液 W2， 13000rpm 离心 1min ，弃滤液；重复一遍 空柱 13000rpm 离心 1min，然后室温安排 3min，使残留乙醇挥发 取出吸附柱，放入一个洁净的离心管中，在吸附膜的中间加 5
10、0μl 洗脱缓冲液(Eluent)，室温安排 1min，13000rpm 离心 1min 洗脱质粒 DNA， -20生存备用 清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿参加适量的蒸馏水刷洗，23 次。并用滤纸擦拭洁净 空白比较比色测定 向比色皿参加 98ul 蒸馏水，进行 Blank 调零 再向比色皿参加 2ul 的质粒 DNA，于紫外分光光度计上进行sample测定，记录相关数据 4 . . 质粒 DNA 的酶切判定 5 . 琼脂糖凝胶电泳 四、 结果与讨论 ： （一）实验现象 1.参加溶液 P1，出现悬表现象； 2.参加溶液 P2,温和混匀，溶液会变得清亮； 在一个洁净的 1.5mlEP 管中
11、按顺序依次参加下述试剂 无菌水 9.0μl、10×M 酶切缓冲液 2.0μl、 质粒 DNA 7.0μl、 Hind III (15U/ul) 1.0μl、 EcoR I (12U/ul) 1.0μl 小心混匀试剂，将 EP 管置于恒温水浴箱中 371.5 小时。 取质粒 DNA、经酶切反响后的 DNA 片段和 PCR扩增的 DNA 各 6μl 于三个 EP 管中并做好标记 往每个 EP 管中参加 1μlGelview 染料，室温安排一分钟 用微量加样枪分别各吸取 10ul，按序号参加到电泳仪的凝胶孔中 电泳 30 分钟 取出凝胶 紫外光下
12、视察，拍照 3.参加溶液 P3,有白色絮状沉淀生成； 4.电泳时，可视察到在电流作用下，点样的溶液出现电泳现象，电泳速度差别。 在紫外检测仪条件下，可以视察到差别的物质出现差别的电泳带。 （二）实验结果 原始实验数据 丈量次数 质粒 DNA 浓度（ug/ml） Ratio 比值(A260/A280) 1 148 1.46 2 106 1.52 3 115 1.45 平均值 123 1.47 电泳后的图片 A:PCR 目的条带 B:酶切片段 C:质粒 DNA （四）实验阐发 1.由上数据可知，Ratio=1.47 A260/A2801.8 表明样品中含有较多的卵白质（芳香族） 2. 在图片中，其
13、他三类 DNA 与 Maker 相比力，可知质粒 DNA 的分子巨细在 2500bp-3500bp，酶切反响的质粒 DNA 片段分子巨细在 2800-3000bp 和 400-500 左右，PCR 的 DNA 分子巨细在 400-500bp。根本切合预期。 （四）实验讨论 1.质粒 DNA 中出现三条带，分别对应超螺旋质粒 DNA、线性 DNA 和开环状质粒 DNA。这三种差别构型的分子有差别的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从上到下分别为：超螺旋型 DNA、线性分子、开环状分子。, 2.对付实验结果中：A260/A2801.8 的可
14、能原因为： A.在质粒 DNA 的提取实验的取上清液步调中吸入沉淀导致引入较多的卵白杂质，进而导致后续实验中因卵白质量较多而难以去除。 B.可能为试剂污染引起杂质卵白的引入。 3.实验中需注意的事项： 用微量加样枪加试剂时，同种试剂可以不消换吸头，每次换差别试剂时要记得换一个新吸头。 在 PCR 中，如果配好的反响液较多沾到管壁上，要将 PCR 反响管置台式离心机中瞬时离心，使反响液会合于管底，然后才将反响管放到基因扩增仪上。 在质粒 DNA 提取的实验中，参加溶液 S2 时，时间不能太久，行动要温柔，轻轻颠倒频频。 在电泳实验中，点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。 在电泳中，Geldview 有毒，切勿用手打仗。 思考题： （1）碱裂解法提取质粒时，溶液 I、II、III 的作用分别为？ 答： 溶液 I：螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对 DNA 的降解作用；有利于溶酶体的作用。 溶液 II：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和卵白质变性。 溶液 III：酸性条件下质粒 DNA 复性，变性卵白-SDS+线性 DNA 沉淀，Na+可中和 DNA。 （2）结合实验情况，如何提高限制性酶切的反响效率？ 答： 尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。 酶量的选择任
