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1、IL18基因多态性与原发性干燥综合征的相关性 作者：李恩泽 辛苗苗 胡彬 闫丽萍 李慧【摘要】 目的 探讨IL18基因137G/C、607C/A位点多态性及其血清水平与原发性干燥综合征的相关性。方法 提取受试者白细胞DNA，采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术检测28例原发性干燥综合征病人和52例健康对照者IL18基因607C/A、137G/C位点多态性，酶联免疫吸附(ELISA)法检测两组血清IL18含量。结果 两组IL18基因137G/C、607C/A位点基因型频率及等位基因频率比较差异均无显著性(P0.05)。原发性干燥综合征组血清IL18水平明显低于健康对照组，差异有显著性(t=2
2、4.06,P0.05)。结论 血清IL18水平表达降低可能是原发性干燥综合征的促发因素。【关键词】 白细胞介素18;基因型;基因频率;原发性干燥综合征ABSTRACT Objective To investigate the association of polymorphisms of 607C/A, 137G/C promoters of IL18 gene and its serum level with primary Sjogrens syndrome. Methods The DNA of white blood cells were extracted from subjects
3、,polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) method was applied to detect polymorphisms of 607C/A, 137G/C promoters of IL18 gene in 28 patients with primary Sjogrens syndrome (group A) and 52 healthy controls (group B); serum IL18 was measured in both groups by ELISA.
4、 Results There was no differences in IL18 genotype frequency and allele frequency at position 607 and 137 between group A and group B (P0.05). Serum IL18 in group A was significantly lower than that in group B, with statistical difference (t=24.06,P0.05). Conclusion Decrease of serum IL18 is likely
5、to be a precipitating factor of primary Sjogrens syndrome.KEY WORDS interleukin18; genotype; gene frequency; Sjogrens syndrome原发性干燥综合征(PSS)是以口、眼干燥及关节肿痛为常见表现的一种全身性自身免疫性疾病，常呈现家族聚集性。白细胞介素18(IL18)可诱导IFN、IL2等细胞因子产生，调节Th1/Th2细胞平衡，有增强免疫、抗肿瘤的作用，并参与某些自身免疫性疾病和变态反应性疾病的发生发展。PSS病人CD4+T细胞水平降低，导致Th1和Th2亚群的分布出现异常，进
6、而引起机体细胞因子网络调控失常。本文对PSS病人IL18基因607C/A、137G/C位点多态性以及血清IL18水平进行检测，探讨其与PSS发生的相关性。现将结果报告如下。1 对象与方法1.1 研究对象收集我院风湿免疫科就诊的PSS病人(PSS组)28例，男1例，女27例，年龄2784岁，平均为55.96岁，均符合2002年PSS国际分类(诊断)标准提出的诊断标准。另选健康献血员52例作为对照组，男3例，女49例，年龄2275岁，平均53.2岁;排除相应疾病家族史。两组研究对象均无血缘关系，在年龄和性别比例上均无显著性差异。1.2 检测方法1.2.1 DNA制备 采集受试者空腹静脉血5 mL至
7、EDTAK2抗凝管中，颠倒混匀。离心后提取下层血浆和白细胞层约1 mL移入高压灭菌的离心管中，用酚氯仿异戊醇法抽提细胞DNA。将DNA沉淀移入1.5 mL的LEP管中，12 000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀自然干燥后，加无菌纯水充分溶解，置4 冰箱保存备用。1.2.2 PCR检测 参考文献1设计扩增 IL18基因607位点的特异性引物，2条特异性正向引物序列分别为5GTTGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAC3和5GTTGCAGAAAGTGTAAAAATTATTAA3，共同反向引物序列为5TAACCTCATTCAGGACT3，质控正向引物序列为5CTTTGCTATC
8、ATTCCAG3。137位点2条特异性正向引物序列分别为5CCCCAACTTTTACGGAAGAAAAG3和5CCCCAACTTTTACGGAAGAAAAC3，共同反向引物序列为5AGGAGGGCAAAATGCACTGG3，质控正向引物序列为5CCAATAGGACTGATTATTCCGCA3。607位点的PCR总体系为25 L，包括10PCR缓冲液2.5 L(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.25 mmol/L 的dNTP，约30 ng基因组DNA和1 U Taq聚合酶。质控正向引物0.4 mol/L，一种特异性正向引物0.4 mol/L，共同反向引物0.8 mol/L。扩增参数：首先
9、94 预变性4 min;然后94 变性20 s，62 退火40 s，72 延伸40 s，共行7个循环;随后94 变性20 s，55 退火40 s，72 延伸40 s，共进行35个循环。取2条特异性正向引物分别扩增的PCR产物于20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压80 V，40 min，溴化乙锭染色，紫外线凝胶成像系统观察结果并鉴定等位基因频率。137位点的PCR总体系为25 L，包括10PCR缓冲液2.5 L(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.2 mmol/L dNTP，约30 ng基因组DNA和1 U Taq聚合酶。质控正向引物0.5 mol/L，一种特异性正向引物0.5 mol/L，
10、共同反向引物1.0 mol/L。扩增参数：首先94 预变性2 min;然后94 变性20 s，68 退火60 s，共行5个循环;随后94 变性20 s，62 退火20 s，72 延伸40 s，共进行25个循环。取2条特异性正向引物分别扩增的PCR产物于20 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，电压80 V，40 min，溴化乙锭染色，紫外线凝胶成像系统观察结果并鉴定基因型。2 结 果2.1 IL18基因607位点多态性电泳每份标本分别用2条特异性正向引物做2管PCR，301 bp处为质控条带，196 bp处是A/C等位基因特异性扩增片段。部分标本607位点多态性检测电泳结果如图1。标本只有C等位基因处可
11、观察到长196 bp特异性扩增片段，所以其基因型为CC;标本的2管PCR产物电泳后均可观察到长196 bp特异性扩增片段，故其为CA基因型;标本只有A等位基因处可观察到长196 bp特异性扩增片段，其基因型则为AA。2.2 IL18基因137位点多态性电泳图2为部分标本IL18基因137位点多态性电泳检测结果，每份标本分别用2条特异性正向引物做2管PCR，446 bp处为质控条带，261 bp处为G/C等位基因特异性扩增片段。标本和只有G等位基因处可观察到长261 bp特异性扩增片段，所以其基因型为GG;标本和在两管PCR产物电泳后均可观察到长261 bp特异性扩增片段，其基因型为GC;标本只
12、有C等位基因处可观察到长度为261 bp特异性扩增片段，其基因型则为CC。2.3 两组IL18基因137G/C、607C/A位点基因型频率和等位基因频率的比较两组IL18基因137G/C、607C/A位点基因型频率及等位基因频率比较，差异均无显著意义(P0.05)。见表1、2。2.4 两组血清IL18水平的比较PSS组病人和对照组的血清IL18水平分别为(49.3715.77)和(476.7993.17) ng/L，两组比较差异有显著性(t=24.06,P0.05)。见表2。表1 IL18基因607 C/A位点多态性分布及其比较(例(/%)组别n基因型频率CCCAAA等位基因频率CA对照组52
13、13(25.0)28(53.8)11(21.2)54(51.9)50(48.1)PSS组287(25.0)14(50.0)7(25.0)28(50.0)28(50.0)表2 IL18基因137 G/C位点多态性分布及其比较(例(/%)组别n基因型频率GGGCCC等位基因频率GC对照组5238(73.1)13(25.0)1(1.9)89(85.6)15(14.4)PSS组2822(78.6)5(17.9)1(3.5)49(87.5)7(12.5)3 讨 论PSS是一种慢性系统性自身免疫性疾病，在多种因素的共同作用下，可导致机体细胞和体液免疫异常，表现为淋巴细胞和浆细胞对靶器官的进行性浸润，造成靶
14、器官功能障碍。研究表明，PSS病人疾病活动期体内T细胞亚群数量分布存在明显异常，表现为CD4+T淋巴细胞水平降低，而CD8+T淋巴细胞水平升高23。CD4+T淋巴细胞水平降低，导致Th1和Th2亚群的分布出现异常，进而引起机体细胞因子网络调控失常，如PSS活动期病人体内IFN等细胞因子水平有明显下降，对疾病的进展影响较大4。IL18属于IL1家族成员，它可诱生IFN等细胞因子。INF的生成可促进Th0细胞向Th1细胞分化，从而调节Th1/Th2细胞平衡，因此认为，IL18是调节Th1/Th2细胞因子的重要因子5。MATERA等6研究表明，IL18在IL12诱导新生CD4+T淋巴细胞分化为Th1细胞时起加强作用，在IL12协同作用下，IL18可强烈诱导IFN等Th1型细胞因子的产生，导致组织损伤。本研究结果显示，PSS病
