从整型医生到诺贝尔奖从整型医生到诺贝尔奖- -山中伸弥的研究历程山中伸弥的研究历程 引言引言 山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两 年前在听完他的讲座后我兴致很高地写了两篇博客，这些天我却没有 多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的工作我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于 怀这些所谓的重大项目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之 后却通常草草收场如果那些重大项目真的能实现立项当初的用意， 那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了广大科研人员都觉得这种运行模 式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在 进行着而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规 律，总是一再地问做基础研究有什么用Shinya Yamanaka 的成功是典型的小实验室自由探索的成功他 的成功再一次提示，有相当多的科学突破是不可预测的如果中国有 大批优质的小实验室得到稳定的资助，那么类似的科学突破就会随机 但是必然地产生从这种意义上讲，展示 Shinya Yamanaka 在研究过 程中的这种随机性和必然性，向公众科普科研活动是如何进行的，是 值得我花一点时间的。
解析 Shinya Yamanaka 发现诱导干细胞（iPS）的来龙去脉比较 简单，就是跟踪他顺次研究的基因: ApoBEC1-Nat1-Fbx15，最后发现 iPS有趣的是他在顺次研究这些基因的时候转了两次方向：ApoB 是 血脂蛋白，研究它的剪切酶（或者叫编辑酶）ApoBEC1 是为了调节血 脂，但是却发现 ApoBEC1 过表达的小鼠得了肝癌；为了研究致癌机 理，他找到 ApoBEC1 的下游蛋白 Nat1，Nat1 的敲除导致小鼠在胚胎 期死亡，以及胚胎干细胞在体外无法分化；于是他又开始研究起胚胎 干细胞，找到许多胚胎干细胞特异表达的基因，其中之一是 Fbx15， 最后用 Fbx15 敲除鼠建立 assay（筛选方法/系统），幸运地筛选出了 iPS整形外科到博士阶段整形外科到博士阶段Shinya Yamanka 念高中时迷上柔道，因为受伤经常上医院，他在 爸爸的建议下随后考入国立神户大学医学部，准备以后做一名整形外 科医生大学毕业做临床实习期间，他发现自己对手术其实没有什么 天分，别人做 20 分钟的手术他两个小时也未必完成；并且他觉得做医 生再优秀也只能帮助少数的病人，而医学研究有成果的话通常可以帮 助更多的病人，所以他的兴趣转向基础医学研究。
在大阪市立大学博士期间，Shinya 的主要工作是研究血压调节的分子机理[1, 2]在研究 过程中，Shinya 对小鼠基因敲除和转基因技术感到震惊，于是他在申 请博士后位置的时候联系的都是利用这些技术的实验室博士后阶段博士后阶段-ApoBEC1这位失败的整形医生最后被加州 Gladstone Institute 的 Thomas Innerarity 纳入门下（图一）Thomas 实验室研究的是血脂 调节，跟 Shinya 博士期间的工作有点关系Shinya 的新课题是研究 ApoB mRNA 的剪切蛋白 ApoBEC1ApoB 是低密度脂蛋白的主要构成成分ApoB mRNA 可以被剪切 酶 ApoBEC1 剪切，形成两种不同大小的蛋白：全长的 ApoB100 和大 约一半长的 ApoB48经过剪切后的 ApoB48 在血浆中会被迅速清除 Thomas 预测，如果在肝脏中过表达 ApoBEC1，那么血脂就可能降低； 如果这个模型可行的话，也许未来通过基因疗法可以帮助一些肥胖病 人降低血脂Shinya 一周七天地勤奋工作，花了六个月做成了转基因鼠有一 天早上，帮他维护小鼠的技术员告诉他：Shinya，你的许多小鼠都怀 孕了，可是小鼠是公的。
Shinya 说你不是跟我开玩笑吧他到老鼠房 一看，果真有很多公鼠看起来怀孕了他杀了其中几只，发现原来是 小鼠得了肝癌，肝脏肿大撑大了肚皮ApoBEC1 过表达后低密度脂蛋白是降低了，但是高密度脂蛋白却 升高了，同时还得了肝癌，这买卖不合算啊[3]Shinya 在一次讲座中 总结了其中的经验教训：其一，科学是不可预测的；其二，不要尝试 在病人身上做新基因的治疗；其三，也许最重要的是，不要相信导师 的假说Thomas 对结果不能符合预期很失望，但是这个预想之外的结果却 引起了 Shinya 的好奇：究竟是什么机理使小鼠得肿瘤的呢？好在 Thomas 足够开明，他允许 Shinya 偏离实验室的主要方向，继续探索 ApoBEC1 的致癌机理可以想见，ApoBEC1 过表达以后也可能会剪 切 ApoB 之外的其它 mRNA，找到这些 mRNA 也许可以解释 ApoBEC1 为什么能致癌由于已知 ApoBEC1 需识别底物 mRNA 的特异序列才能剪切， Shinya 据此设计引物扩增，找到了 ApoBEC1 的一个新底物-抑制蛋白 翻译的基因 Nat1ApoBEC1 过表达后，Nat1 蛋白消失[4]。
从逻辑上 讲，如果剪切 Nat1 是导致 ApoBEC1 致癌的重要分子，那么 Nat1 敲 除的小鼠也会长癌图一：忆往昔青涩头发稠图一：忆往昔青涩头发稠Shinya Yamanaka 和他的导师 Thomas Innerarity 在 Gladstone Institute 实验室 [15]基因敲除比起转基因要更加复杂，需要把构建的质粒原位整合到 体外培养的胚胎干细胞中基因敲除技术不就是 Shinya 博士阶段做梦 都想学的技术吗？于是 Shinya 找到所里做基因敲除的专家，当时还是 助理教授的 Robert Farese，从他的助手 Heather Myers 那里学了这项 技术的每个细节，并成功地获得了 Nat1 敲除的杂合鼠 Heather Myers 是 Shinya 的终生好友；Shinya 发现 iPS 以后，也公开 表达了对 Heather Myers 的感激，因为是她告诉 Shinya，胚胎干细胞 不仅仅是做敲除小鼠的手段，其本身也可以是非常有趣的研究对象在 Shinya 兴致勃勃地继续追问 Nat1 的功能时，他的妻子带着女 儿离开他回到了日本半年后他决定中断研究带着三只珍贵的 Nat1 杂 合鼠，也跟随家人回国。
大阪的毛毛虫阶段大阪的毛毛虫阶段-Nat1凭借他在博士后期间发表的四篇高质量的一作论文，1996 年 Shinya 在母校大阪市立大学找到了助理教授的职位，继续他的 Nat1 研究再一次地与预测出现偏差：Nat1 敲除后，纯合子小鼠在胚胎发育 早期就死了，根本无法观察到成鼠是否得肿瘤Shinya 进一步研究发 现，敲除 Nat1 的胚胎干细胞在体外根本不能像正常干细胞一样分化[5] 此时他想起了 Heather Myers 的话：胚胎干细胞不仅是研究的工具， 它本身也可以是非常有趣的研究对象他的关注点开始转移到胚胎干 细胞上来在刚回大阪的头几年，Shinya 由于刚起步，只能得到少量的研究 资助，他不得不自己一个人养几百只小鼠，日子过得非常艰苦同时 大阪市立大学医学院的基础研究很薄弱，周围的人不理解 Shinya 研究 Nat1 在胚胎干细胞中的功能有什么意义，总是劝说 Shinya 做一些更 靠近医药临床方面的研究而 Nat1 的研究论文提交给杂志后一直被据 稿种种压力与不得志，Shinya 因之得了一种病叫 PAD（Post America Depression，离开美国后的抑郁症；自创的玩笑 话），几乎要放弃科研回锅做整形医生。
在他最低谷的时候，有两件事情把他从 PAD 中挽救了回来其一 是 James Thomson（俞君英的导师，2007 年几乎与 Shinya 同时宣布做出了人的 iPS） 在 1998 年宣布从人的囊胚中采集并建立了胚胎干 细胞系：这些干细胞在体外培养几个月后还可以分化成不同胚层的细 胞，比如肠上皮细胞，软骨细胞，神经上皮细胞等[6]这给了 Shinya 巨大的鼓舞，他开始更加坚信胚胎干细胞研究是有意义的，将来必然 有一天会用于临床第二件事是条件更加优越的 奈良先端科学技术研 究生院看上了他的特长，招聘他去建立一个做基因敲除小鼠的 facility（中心？设施？），并给他提供了副教授的职位奈良的成蛹阶段奈良的成蛹阶段-Fbx15千辛万苦脱了几层皮后，Shinya 终于拥有了自己独立的实验室 第一次可以招帮手，好爽啊但是问题又来了：研究生的生源是有限 的，学生会倾向于选择资历更老条件更好的实验室，而不一定会选择 刚起步的实验室；你想招但人家不来啊为了吸引学生到他实验室， Shinya 冥思苦想了好一阵，提出了一个雄心勃勃的计划，声称实验室 的远景目标是研究怎么从终末分化的成体细胞变回多能的干细胞。
当时科学界的主流是研究怎么把胚胎多能干细胞分化成各种不同 组织的细胞，以期用这些分化的功能细胞取代受损的或者有疾病的组 织细胞Shinya 认为自己的实验室没有实力跟这些大牛竞争，那不如 反其道而行之，研究怎么从分化的细胞逆转为多能干细胞当时科学界的主流观点认为，哺乳动物胚胎发育过程中的细胞分 化是单向的，就像是时间不可逆转这个观点也并非没有破绽，比如 植物组织就具有多能性，一些植物的茎插入土壤会重新长出一棵植株， 也即已经分化的茎细胞可以改变命运分化出新的根茎叶细胞而早在 1962 年，也即 Shinya 出生的那一年，英国的 John Gurdon 爵士（与 Shinya 共享诺贝尔奖）报道了他的惊人发现：把蝌蚪的肠细胞核移植 到去核的蛙卵中，新细胞可以发育成蝌蚪[7]进一步地，为了说服人 们接受终末分化的细胞核也具有全能性，他利用相同的转核技术，用 成蛙的细胞核发育出蝌蚪，用胚胎期分化的细胞核发育出了可生育传 代的成蛙[8, 9]1997 年，Ian Wilmut 和 Keith Campbell 基于同样的 原理，把羊的乳腺细胞核移植到去核的羊卵中，成功地培育出了克隆 羊多莉[10]。
2001 年，科学家发现，通过与 干细胞融合，胸腺细胞核 获得了很大程度的重编程[11]Shinya 计划的第一步是找到尽可能多的，类似于 Nat1 参与维持 干细胞功能的因子（维持因子的意思是这些因子是胚胎干细胞在体外 培养维持多能性所必需的）他大胆推测，如果过表达这些维持因子 也许可以让终末分化的细胞变回多能干细胞一旦成功，诱导的多能 干细胞会有着胚胎干细胞所不具备的优势：它不仅可以绕开胚胎干细 胞引起的伦理问题，病人本身的诱导干细胞改造后重新植入病人时， 由于是自身的细胞，将不会有免疫排斥的难题在这个远大前景的感召下，Shinya 果然“忽悠”了三个学生加入他 实验室很快地，他们鉴定出一系列的在胚胎干细胞特异表达的基因 其中一个基因就是 Fbx15Shinya 的学生 Yoshimi Tokuzawa 发现 Fbx15 除了特异表达于胚胎干细胞外，它还能被另外两个胚胎干细胞 维持因子 Oct3/4 和 Sox2 直接调控Shinya 跟 Yoshimi 说：Fbx15 应 该参与维持干细胞多能性和胚胎的发育，我猜你没有办法得到 Fbx15 敲除的纯合鼠Yoshimi 构建质粒做了基因敲除小鼠，把染色体上的 Fbx15 基因通过同源重组替换成抗 G418 药物的基因 neo。
复杂的生命又一次愚弄了 Shinya：Fbx15 敲除的纯合鼠活得很健 康，没有显见的表型Shinya 又挑战他的学生说：好吧，Fbx15 也许 不是小鼠胚胎发育所必需的，但是它应该是维持体外胚胎干细胞所必 需的，我打赌你没有办法在胚胎干细胞中彻底敲除这个基因勤快的 Yoshimi 于是用较高浓度的 G418 从干细胞中筛到了纯合的敲除株，还 是活得好好的，没有表型[12]Shinya 后来在回忆的时候打趣到：小 鼠很 happy，细胞也很 happy，唯一不 happy 的就是。