1、细胞水平 ELISPOT原理：本实验旨在测IFN-γ的分泌情况，T细胞受抗原刺激后分泌IFN-γ，同时被PVDF薄膜上 特异抗体捕获微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素 标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使 其呈色，有反应作用的细胞会留下约10-20mm大小染色的斑点方法：（1）获得PBMC（2）IFN-γ诱导分泌：阳性对照品加入PMA，阴性对照不加刺激物3）主要方法：处理PVDF孔板，在活化后预包被好抗体的平板中分别加入阴性PBMC及 阳性PBMC，37℃孵育第二天洗板后,加缓冲液后，孵育清洗， 加入稀释的检测抗体， 孵育1小时, 洗板后再加入亲和素碱性磷酸酶再次孵育最后加入BCIP/NBT显色，倒去液体， 将板倒置以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，4℃下放置一夜后读取点数，计算待测样 本中IFN-γ的含量，从而评估T细胞的功能细胞内细胞因子染色细胞内细胞因子染色原理：通过体外多克隆激活剂或特定的抗原激活 T 细胞，同时抑制 IFN-γ 释放到细胞外,使之在细胞质内蓄积，信号增强增加细胞膜的通透性后，用抗细胞因子的抗体与胞内特定的分子相结合，通过非相关特异性同型匹配的抗体作为对照，以确定静止的与无细胞因子分泌的细胞的最小荧光背景，这样就可以用流式细胞仪检测不同细胞亚群分泌的细胞因子。
方法：取 T 细胞，用 PMA 和 Ionomycin 同时刺激后孵育→→加入蛋白转运抑制剂继续培养 →→细胞表面染色→→固定，破膜→→重悬细胞→→加入荧光标记抗体，避光→→缓冲液 重悬，流式细胞仪检测→→结果分析二、蛋白水平 ELISA 原理： 本实验所测T细胞分泌的IFN-γ有多个表位，采用双抗体夹心法来测含量，IFN-γ与酶 结合后不改变其原有的特异性及免疫反应性，同时也不影响酶的催化效能当存在相应的 酶底物时，酶能催化产生有颜色的产物，颜色的有无和深浅可以反映IFN-γ的分泌情况 方法： (1)获得PBMC：将采集的静脉血置于肝素抗凝试管中,每份分别用等量RPMI1640培养液 稀释，以淋巴细胞分离液分离PBMC (2)IFN-γ诱导分泌：阳性组每孔加入一定量ＰＨＡ，阴性组不加ＰＨＡ细胞经37℃ 5%CO2,培养72h，2000rmp高速离心20min,取上清液 (3)主要方法：用一抗包被，放置在反应板中4℃过夜洗涤三次，将已知含量的IFN- γ标准品倍比稀释于各孔中，并设置阳性组、阴性对照组、空白对照组加样后，孵育， 洗涤每孔加入酶，再次孵育，洗涤加入底物后显色，读取OD值，绘制标准曲线。
根据 参考蛋白的含量计算待测样本中IFN-γ的含量，从而评估T细胞的功能Western blot原理： IFN-γ 在本质上属于蛋白质，因此可以采用 Western-Blot 进行检测经过 SDS-PAGE 分离后转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质， 且能保持原有的物质类型和生物学活性不变以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与 对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自 显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分 方法：蛋白质样品获得→→制胶（1%琼脂糖封底；装配电泳槽；灌注分离胶；灌注浓缩胶） →→样品处理→→电泳→→转移→→免疫学检测（封闭过夜；一抗 37°C 1h 洗 3 次；二 抗 37°C 1h 洗 3 次；底物显色 5-15 分钟；ddH2O 洗涤）→→结果检测三、基因水平 Northern blot 原理：采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的 RNA 分离开来，随后将其原为转移至固 相支持物（硝酸纤维素膜）上，再用放射性（或非放射性）标记的 DNA 或 RNA 探针，依 据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影） ，以目标 RNA 所在位置表示其 分子量的大小，而其显影强度则可提示目标 RNA 在所测样品中的相对含量（即目标 RNA 的丰度）虽然 Northern 也可检测目标 mRNA 分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在 组织细胞中有无表达及表达的水平如何。
方法：： 总 RNA 提取→→变性胶的制备→→样品制备→→电泳→→将 RNA 从变性胶转移到硝 酸纤维素膜上→→转移完毕后，凝胶置紫外灯下，观察是否有残留 RNA→→膜烤干保存 →→探针的制备→→探针的纯化及比活性测定→→预杂交→→探针标记→→杂交→→洗膜 →→压片暗盒中自显影→→去除膜上的探针RT-PCR原理：将 RNA 的反转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术 对 T 细胞的总 RNA 进行抽提，以其中的 mRNA 作为模板，在 Oligo（dT）逆转录酶作用 下，把 RNA 反转录为 cDNA，然后设计 IFN-γ 基因引物进行 PCR，通过分析电泳条带灰 度值，得出 IFN-γ 基因 mRNA 转录水平的相对量的变化，从而检测 T 细胞中 IFN-γ 表达 水平 方法：T 细胞总 RNA 的提取→→逆转录合成 cDNA→→PCR 反应→→PCR 反应产物的电泳 检测→→凝胶成像分析。