鹦鹉热衣原体 Mip 基因 原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备,时 间：2017- 6 - 14,,关于问题的研究,选题背景及意义,目的基因的获取及扩增,目的基因的克隆及鉴定,目的蛋白的诱导表达及纯化,,,,,1,选题背景及意义,,选题背景及意义,鹦鹉热衣原体(Cps)是一种专性细胞内寄生，有独特生活周期的原核细胞型微生物，也是一种重要的人畜共患病病原体，具有广泛的感染谱人主要通过吸入有感染性的分泌物而发生感染，感染后可引起非典型性肺炎和败血症等疾病目前为止，Cps 的确切致病机制不清楚，也无有效疫苗上市，开发有效的疫苗是预防 Cps 感染最根本的措施选题背景及意义,巨噬细胞感染增强蛋白(Mip)是衣原体含量最丰富的脂蛋白，在衣原体各种属间都存在且高度保守相关研究表明：Mip可刺激THP1细胞产生一系列炎症因子，参与衣原体对宿主细胞的侵袭及炎症反应Mip可诱导小鼠产生以Th1型为主的细胞免疫反应，且抗感染实验表明免疫后的小鼠能抵御生殖道衣原体感染及再感染等由此可见，衣原体Mip蛋白是一种较理想的疫苗候选抗原本实验拟克隆Cps Mip基因，构建原核表达载体， 诱导表达及纯化可溶性蛋白，并制备多克隆抗体。
2,目的基因的获取及扩增,,获取目的基因（Cps Mip基因）,,,,,,,分离mRNA,合成cDNA双链,制备载体,将重组体导 入受体细胞,鉴定cDNA文库,分离和鉴定 目的cDNA克隆,,提取总RNA,连接 cDNA与载体,,图1 cDNA文库法获取目的基因,,,,,,,,,,,,,,导入酵母细胞,构建重组质粒,分离目的基因,培养合适酵母,重组酵母的方法,此实验采用重组酵母的方法 原因如下： 酵母对培养基的要求低，价廉易得 酵母细胞生长快，生长率高 酵母系统容易放大,,扩增目的基因（PCR原理）,,Cps Mip 基因上游引物设计,上游引物:5'-CGCGGATCCATGAAAAAACAATGGTATT-3' 下划线为 Bam H I 酶切位点,,Cps Mip 基因下游引物设计,下游引物: 3'-CCGCTCGAGTCATGAAGCTGTGTTTTT-5' 下划线为 Xho I 酶切位点,PCR反应体系,10×缓冲液 10μL 4种dNTP混合物 各200μmol/L 引物1、2 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2μg Taq DNA聚合酶 2.5U 总体积： 加水至100μL,,Cps Mip基因的PCR扩增预期结果,Cps Mip 基因经PCR扩增后，1. 5% 的琼脂糖凝胶电泳， 预期目的基因大小如下图：,目的条带预测位置,图2：Cps Mip 基因 PCR产物琼脂糖凝胶电泳,,,,,3,目的基因的克隆及鉴定,1.电泳缓冲液配制 2.融胶 3.倒胶 4.加样 5.电泳 (先低电压低电流产生细条带， 便于切胶，再高电压快速分离),PCR产物的琼脂糖凝胶电泳回收,6.观察 7.切胶 8.融胶 9.结合（吸附柱） 10.洗涤 11.洗脱,,感受态细胞的制备（CaCl2法）,（1）在无菌环境中，挑取冻存于-70℃冰箱的菌种E.coli BL21划线接 种于不含任何抗生素的LB琼脂平板上，37℃倒置培养12~16h左右; （2）从平板中挑取单个菌落，接种5mLLB液体培养基中，37℃、200rpm， 过夜振荡培养; （3）次日在无菌环境下吸取1mL菌液加入到50mL含卡那霉素的LB液 体培养基中，37℃、200rpm振荡培养，至菌液的OD600值在 0.3~0.5之间;,,感受态细胞的制备（CaCl2法）,（4）无菌条件下，将菌液转移到冰预冷过的无菌离心管中，冰浴15min， 使培养物冷却至0℃; （5） 4℃、4000rpm离心10min轻轻倒掉上清，回收沉淀，加入10mL冰 预冷的 0.1mol/L CaCl2溶液重悬沉淀，冰浴10min(务必放冰上); （6） 4℃、4000rpm离心10min，收集沉淀，用2mL冰预冷0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌体; （7）分装重悬好的感受态细胞，每管100 µ L，-70℃冰箱保存待用。
将Cps Mip基因连接到T载体上,,重组质粒的转化,将重组质粒转化至 E. coli BL21 感受态细胞中，用含卡那霉素的 LB 固态培养基培养过夜用质粒DNA小量抽提试剂盒制备质粒DNA,1、菌液培养：挑去单克隆菌落接种到5μL含卡那霉素的液体培养 基中，37 ℃ 培养12h； 2、收集菌体：将菌液转移到1.5mL离心管中，10000r/min， 1min,将培养液彻底吸掉； 3、离心管中加250μL预冷的SolutionI； 4、加入250 μLSolution II上下翻转4-6次，呈蛋清状； 5、加入350 μLSolution III上下翻转8-10次，室温放置2- 5min，12000r/min，5min；,,用质粒DNA小量抽提试剂盒制备质粒DNA,6、将上清液转入吸附柱中，6000r/min，1min弃去废液； 7、加入500 μL W1 Solution 12000r/min，1min弃去废液； 8、加入500 μL Wash Solution 12000r/min，1min弃去废液； 9、将8重复一次； 10、12000r/min，1min 空转一次； 11、开盖挥发乙醇； 12、超纯水分两次洗下DNA。
质粒的双酶切,将鉴定后的阳性重组质粒用 Bam HI/Xho I 进行双酶切 ddH2O 36μL 10×M Buffer 8μL BSA 8μL Bam HI 4μL Xho I 4μL 质粒 20μL 37 ℃ 水浴5h,,重组质粒的双酶切鉴定预期结果,重组质粒经Bam H I和Xho I双酶切后，1.5% 的琼脂糖凝胶电泳结果显示，预期目的基因大小如下图：,目的条带预测位置,图 3： 重组质粒双酶切鉴定,按特殊设计构建的，能使克隆于特定位点的外源基因在宿主细胞中正常转录并翻译成相应蛋白质的载体 组件主要包括：启动子及操纵位点序列、多克隆位点、转录及翻译信号、复制起始区、抗生素抗性基因等 外源基因按正确读码方向克隆于启动子下游的多克隆位点上，使外源基因获得转录及翻译表达载体,表达载体,Ⅰ型：转录起始区(调控序列＋启动子) ＋ 终止子 Ⅱ型：转录起始区＋翻译起始区(核糖体结合序列和起始密码子) ＋终止子 Ⅲ型：转录起始区＋翻译起始区＋信号肽链编码区＋终止子(分泌型),,常用的质粒载体,,原核表达载体的选择,,Bam H I,Xho I,,原核表达载体的选择,,原核表达载体的构建,纯化的Cps Mip PCR扩增产物和pET-28a(+)质粒经 Bam HI和Xho I双酶切后，用T4连接酶连接，构建原 核表达载体pET-28a(+)- Cps Mip 。
重组质粒的转化,将重组质粒转化至 E. coli BL21 感受态细胞中，用含卡那霉素的 LB 固态培养基培养过夜阳性重组子的筛选,挑取初筛阳性PCR单个菌落，接种于含卡那霉素的 LB 液体培养基中，提取质粒做双酶切鉴定，并送往生物公司测序4,目的蛋白的诱导表达及纯化,,Cps Mip蛋白的诱导表达,挑取经测序鉴定的阳性菌接种到含卡那霉素(终浓度100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃过夜培养第2d以体积比1:100接种于含卡那霉素的LB液体培养基，37℃振摇至OD0.8左右，向菌液中加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，30℃诱导3h，同时设未诱导(不加IPTG)的重组体组和空载体组为对照IPTG:异丙基硫代半乳糖苷,是一种作用极强的诱导剂,是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质，相当于异乳糖 离心收集菌体，并用 PBS 洗涤沉淀，再将沉淀重悬于裂解缓冲液中，并加入溶菌酶(4.0mg/ml),室温放置30min，离心取上清，进行SDS－PAGE检测p ET－30a－Cps Mip 在 E. coli BL21 中诱导表达,Cps Mip蛋白的诱导表达预期结果,将PET-28a(+)-Cps Mip重组质粒转化至E.coli BL21，IPTG诱导表达后，重组菌在Mr约为34KD处有一明显条带。
预期目的蛋白大小如下图：,图3：PET－28a－Cps Mip 在 E. coli BL21 中诱导表达,目的条带预测位置,,Cps Mip蛋白的纯化,同样条件对重组蛋白进行大规模诱导表达，离心后，取上清，经HIS纯化树脂纯化，利用咪唑洗脱吸附在Ni－NTA－His 亲和层析柱上的Cps Mip蛋白，从而得到纯化的Cps Mip蛋白Cps Mip蛋白纯化的预期结果,经Ni－NTA－His亲和层析柱纯化后在Mr约34kD处有一条唯一的蛋白带，预期目的蛋白大小如下图：,图4：Cps Mip重组蛋白纯化的SDS －PAGE 结果,目的条带预测位置,,抗Cps Mip蛋白多克隆抗体制备,用重组蛋白免疫 BALB小鼠后，ELISA法检测小鼠血清中抗Cps Mip特异抗体，其效价达1: 128000，血清阳性反应率为100%经PBS、空质粒免疫4次后，小鼠血清中未检出 Cps Mip 特异性抗体Thanks for your attention,。