山东农业大学大学生研究训练（SRT）计划项目实验报告项目名称：不同NaCl浓度处理对牧草幼苗生长及生理特性的影响 主 持 人： 郭慧敏 参 加 者: 刘鲁霞、杜晓晴、姚爱冬所在学院： 林学院 专业年级： 07级水土保持与荒漠化防治 指导教师: 李红丽 职称 副教授 不同NaCl浓度处理对牧草幼苗生长及生理特性的影响171引言目前，全世界旱地农业面临干旱缺水、水土流失、风蚀沙化和土壤盐碱化四大生态环境问题，许多干旱半干旱地区脆弱的农业生产体系由于盐碱危害而面临崩溃全球性日益严重的土壤盐碱化是当今世界面临的危机之一据联合国教科文组织（UNESCO）和粮农组织（FAO）不完全统计，全世界盐渍化土地约占陆地总面积的三分之一，为4×108～9×108hm2(Malcolm E，1998)我国有1亿多hm2各种盐渍土地，约有10%左右的耕地常年受到盐渍化和次生盐渍化的危害(王遵亲，1993)土壤盐碱化严重制约着农业生产，地表裸露使得风沙肆虐，是影响生态环境的重要因素之一，已成为限制农业生产发展的一个重要因素(王晓鹏，2009)。
在耕地有限，人口不断增长的今天，如何利用和开发我国上亿公顷的盐渍化土壤，对我国国民经济的发展和生态环境的改善均具有重大的战略意义纵观国内外，改良利用盐碱地的途径较多，从农村环境保护的角度出发，生物措施是最经济、有效的方法，即以生物（耐盐植物或盐生植物）适应环境并达到改良利用盐碱地的目的土壤盐碱化的地表植被稀疏、土壤肥力较低，在盐碱地上种植农作物生长受到限制、产量低、品质劣(Shannon，1998；Munns，1998；Borsani，et al.，2003)牧草具有改良土壤、提高地力、绿化国土、美化环境等优点(刘国道，2003)为此，可通过在盐碱地种植耐盐性牧草来提高地表植被覆盖率，改良盐碱化的土壤，并可增加牧草收获，发展畜牧业，达到生态与经济共赢的目的目前牧草耐盐性研究取得了很大成就，人们已经对多种牧草进行了耐盐性评价，并提出了一些适于各盐碱地区栽植的草种，如甘肃的碱茅，黑龙江的星星草，山东的苜蓿等，但总体上品种比较单一对于牧草的种子发芽期的耐盐性研究较多，而对于牧草幼苗期耐盐性生长，尤其是牧草幼苗期的一系列生理生化指标在盐胁迫下的变化研究较少在评价牧草抗盐性方面，人们多用一些单一的指标，这不能客观地反映牧草的真实抗性，因此需建立一套客观评价牧草抗盐性的方法。
另外，耐盐牧草在我国的主要是引种工作一般都是从本地筛选或外地引进耐盐牧草品种用于改良盐碱地但是推广工作由于各方面的原因而受到限制，目前，应用较多的牧草品种有：碱茅、星星草、大米草、田箐、黄花草木樨和白花草木樨等，这些品种只在少数盐碱地区的盐渍化土地中得到了大面积的应用牧草的品种繁多，研究牧草耐盐性的却很少而我国的盐渍化土壤又呈现出很多不同的类型，如何根据牧草的各个生理指标，判断牧草在盐渍化土地的适应性，快速评价牧草的耐盐性，为牧草的适应性选择提供依据，是亟待解决的问题基于此，本文采用9种不同浓度的NaCl溶液，对7种禾本科牧草的幼苗进行盐胁迫处理，测定了处理后幼苗生长特性及其生理生化变化，并以测定的各生理生化指标为参数，采用隶属函数法进行耐盐性评价，以期选择出优良的耐盐牧草，为盐碱地改良、植被恢复及畜牧业发展提供科学依据2试验材料与方法2.1 试验材料与实验设计根据滨海盐碱土的特点，选取国外引进与乡土禾本科牧草种小狼尾草（XL，本地种）、巨人狼尾草（JRL）、白狼尾草（BL）、布尼狼尾草（BNL）、三叶芒（SYM）、细叶芒（XYM）、晨光芒（CGM）7个禾本科植物种，于2010年6－10月，以人工配制的不同浓度NaCl 盐处理幼苗，共设8个浓度梯度，分别为：0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%，以蒸馏水处理的为对照，共计9种处理。
每种用塑料育苗钵人工培育18盆，处理结束后对不同品种、不同处理的幼苗生长特性及细胞膜透性、叶绿素含量（a、b及总量）、脯氨酸含量、丙二醛含量等生理生化指标进行测定2.2 研究内容（1）不同NaCl浓度处理对幼苗生长特性的影响研究盐胁迫对种子发芽率、保存率和幼苗植株高度、丛幅等生长特性的影响2）不同NaCl浓度处理叶绿素含量的影响研究不同NaCl浓度胁迫下幼苗叶片的叶绿素a、b含量及总含量的变化3）不同NaCl浓度处理对幼苗渗透调节的影响 研究不同NaCl浓度胁迫下幼苗体内脯氨酸的含量，分析牧草幼苗耐盐性的大小4）对幼苗细胞膜透性的影响 测定不同处理条件下幼苗叶片的电导率值的测定，计算细胞膜透性的大小，分析盐胁迫对幼苗细胞膜系统的影响丙二醛是盐逆境胁迫下产生的一种膜脂过氧化产物，其含量的高低代表膜脂过氧化的程度通过对丙二醛含量的测定，分析盐胁迫对幼苗膜系统的影响5）牧草幼苗的耐盐性评价利用上述参数，用隶属函数法对牧草的耐盐性进行评价2.3试验方法2.3.1 幼苗盐处理挑选籽粒饱满的种子，用3%的H2O2消毒10min后，再用蒸馏水冲洗干净，播于盛有蛭石的塑料育苗钵内，每天浇以蒸馏水直到种子发芽，待幼苗长出两片叶子后，用1/2的霍氏营养液浇灌。
幼苗生长大约40天后，用不同浓度的盐溶液进行胁迫，为避免盐激反应，高浓度胁迫采取每天逐渐增加盐浓度的方法NaCl盐浓度梯度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%，并以不加盐的Hoagland营养液浇灌作对照所有处理均设三次重复处理期间每天用蒸馏水补充蒸发所失的水分并保持盐浓度不变盐胁迫进行7天后，对幼苗的生长特性及细胞膜透性、叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸等生理指标的测定2.3.2 幼苗生长特性测定测定各植物种的发芽率、保存率，并采用直尺测量及观察等方法测定幼苗的植株高度、分蘖数、叶长及叶色等指标2.3.3 相对含水量叶片相对含水量采用蒸馏水浸泡及烘干称重法测定，具体操作为：取待分析叶片，称其鲜重，然后在蒸馏水中浸泡24h后称其饱和鲜重，之后在110℃下烘干，称其干重，计算相对含水量 2.3.4 细胞膜相对透性采用电导法（张宪政，1992）测定将新鲜的叶片用去离子水冲洗除去表面的沾污物，用滤纸吸干外附的水分，称0.1g并剪成切段将剪切后的叶片放入50ml三角瓶中，加20ml无离子水，自然浸泡4～5h，各处理浸泡时间和测定温度要一致，一般在室温条件下进行。
用DDS-Ⅱ型电导仪测定浸泡液的电导度，然后沸水浴20min，冷却至室温再测一次总电导率值以相对电导率表示细胞原生质膜透性大小2.3.5 叶绿素(Chl)含量采用丙酮乙醇混合液法（张宪政，1992）将新鲜的叶片用去离子水冲洗除去表面的沾污物，用滤纸吸干外附的水分剪取的测定叶片如粘附有尘土应先冲洗干净并吸干表面附着水准确称取0.1g左右，用剪刀剪成细条(1~2mm宽)后，放入具塞三角瓶或刻度试管中，加丙酮乙醇混合提取液10ml盖塞，在室温暗处浸提直至材料变白取浸提液在663nm和645nm波长下测定OD值，按如下公式计算叶绿素的含量 式中：A663、A645-分别为叶绿素提取液在663nm和645nm处的OD值；V-提取液体积(ml) ；W-材料重(g)2.3.6丙二醛(MDA)含量用硫代巴比妥酸（TBA）法（邹琦，2000）测定准确称取新鲜材料0.5g，加入5ml 15%的三氯乙酸（TCA）和少量的石英砂研磨后所得匀浆在离心机3000r/min下离心10min取上清液2ml，加0.67%TBA2ml，混合后在100℃水浴锅上煮沸30min，冷却后再离心一次用紫外分光光度计测定在450nm、532nm 和600nm处的OD值，并计算MDA的浓度C： 式中：A532、A450和A600分别代表在450 nm、532nm 和600nm处的OD值。
再根据公式算出单位鲜样组织中的MDA含量(μmol/L)2.3.7脯氨酸(Pro)含量采用磺基水杨酸法（张宪政，1992）测定即称取0.1g经过不同处理的叶片材料，剪碎后放入具塞试管中，加5ml 3%磺基水杨酸溶液，加塞后在沸水浴中提取10min取提取液2ml于具塞试管中，加入2ml水、2ml冰醋酸和4ml酸性茚三酮试剂，摇匀后在沸水浴加热显色60min，取出后冷却至室温，加入4ml甲苯充分震荡或摇动，以萃取红色产物萃取后再静置使其分层，待完全分层后，吸取甲苯层，于分光光度计520nm波长处测定OD值，并用浓度为1~10μg/ml 10个系列的脯氨酸标准溶液同步制作标准曲线（取标准液2ml和2m13%磺基水杨酸溶液代替样品测定中的2ml浸提液），根据回归方程求出脯氨酸含量 式中：C-从标准曲线中查得的脯氨酸浓度(μg/ml)；V-提取液的总体积(ml)；W-测定样品重量(g)；a-测定时取用提取液体积(ml)2.4 耐盐性评价牧草幼苗耐盐性的评价采用模糊数学的隶属函数法，这是目前应用比较广泛的抗逆性综合评定方法这种方法采用Fuzzy数学中隶属函数的方法(李善春，2005)，对供试牧草各个耐盐性指标的隶属函数值进行累加，求取平均数以评定植物的耐盐性。
要知道各指标的隶属函数值，需先求出各个抗盐指标在不同盐浓度下的隶属值，再把每一指标在不同盐浓度下的隶属值累加求平均值，最后再将各品种不同抗盐指标的隶属值累加求其平均值，平均值越大则表示抗盐性越强(穆俊丽等，2009)耐盐性隶属函数值的计算方法如下：(1)如果指标与耐盐性呈正相关，则 (18)(2)如果指标与耐盐性呈负相关，则 (19)式中：X为某一指标的测定值；Xmax为某一指标的测定值中的最大值； Xmin为某一指标的测定值中的最小值；计算各耐盐性指标隶属函数值的平均值(△)，通过比较隶属函数值的大小进行耐盐性排序，其△值越大，耐盐性越强2.5数据处理方法用Excel、 SPSS软件对所得数据进行统计分析，用隶属函数法对牧草的耐盐性进行评价3结果与分析3.1 幼苗生长特性3.1.1 幼苗出苗率和保存率7种禾本科草本的出苗率差异明显，其中三叶芒、细叶芒和晨光芒的出苗率均为0.0%，说明本批次种子质量差，导致后面的生理生化实验也无法进行因而，本实验仅对四种狼尾草的幼苗生长及生理生化进行研究4种狼尾草的出苗率各不相同，白狼尾草、布尼狼尾草、巨人狼尾草和小狼尾草4个草种的出苗率分别为83.6%、64.8%、80.5%和42.2%（图1）。
在分别进行不同浓度的盐处理条件下，4个草种的保存率明显不同，均表现为低浓度下幼苗保存率略有升高的趋势，但各个草种保存率最大时对应的盐浓度有所不同（图2）巨人狼尾草和白狼尾草均在盐浓度为0.4%时保存率达到最大，分别为83.6%和88.5%，而布尼狼尾草和小狼尾草则在0.2%盐浓度时达到最大，分别为80.6%和52.3%之后，随着盐浓度的增大，4个草种的幼苗保存率下降明显，幼苗出现枯黄或死亡在盐浓度达到1.6%时，白狼尾草、巨人狼尾草、布尼狼尾草和小狼尾草的保存率分别为32.6%、30.2%、22.8%和10.4%图1 7个草种的发芽率 图2 盐胁迫下草种的保存率注：JRL、BL、BNL、XL、SYM、XYM、CGM分别代表巨人狼尾草、白狼尾草、布尼狼尾草、小狼尾草、三叶芒、小叶芒和晨光芒以下图表同通过盐分处理试验下幼苗的保存率来看，小狼尾草和布尼狼。