1 第八章免疫标记技术 中国药科大学微生物与免疫学教研室王慧 2 免疫标记技术 免疫标记技术是指用荧光素 酶 同位素等标记抗体或抗原所进行的抗原抗体反应 三大标记技术 同位素标记技术免疫荧光技术酶免疫测定 4 第一节放射免疫测定法 radioimmunoassay RIA 5 放射性同位素 131I 或125I 标记Ag或Ab测定Ab或Ag 通过测定放射活性判断结果 该法常用于测定微量物质 如胰岛素 生长激素 甲状腺素 孕酮等激素 吗啡 地高辛等药物以及lgE等 6 VeteransAdministrationHospitalBronx NY USA 7 与此同时 Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲状腺素获得成功 开创了生物活性物质微量测定技术的新时代 是微量分析方法学上的一个突破 8 优点 特异性强 即抗原抗体的特异性反应 灵敏度高 结果精确 检测范围10 9 10 12g 操作流程简单易行 测量和数据处理自动化 样品用量少 无需复杂的提纯步骤 应用范围广泛 尤其是测量小分子半抗原 缺点 需要昂贵的检测仪器 同位素污染 9 原理 是建立在标记抗原 或配体 和待测抗原 或配体 对有限量的特异性抗体 或受体 的竞争性抑制反应基础上的 最终形成的放射性标记复合物与被测配体 或抗原 呈负相关 因而亦称竞争性放射免疫技术 10 Ag Ab Ag Ab F B Ag Ag Ab 11 RIA测定原理的定量示意图 Ag AgAbAgAb游离AgB FB T 6 26 8 3 53 8 2 62 8 4 44 8 12 返回 13 第二节免疫荧光法 immuno fluorescencetechnique 14 原理 免疫荧光技术又称荧光抗体法 将抗体或抗原标记以荧光素 然后与相应抗原或抗体结合 形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光 借助荧光检测仪 荧光显微镜或用流式细胞仪 测定或定位被检抗原或抗体 异硫氰酸荧光素 FITC 呈黄绿色荧光 巯基化藻红蛋白 PE 呈橙红色荧光 15 16 激发光和发射光 17 抗原抗体反应的高度特异性荧光的敏感可测性显微技术的高度精确性准确 特异 灵敏 快速地检测和定位微量物质 18 优点 特异性强 速度快 敏感性高 能准确检测少量抗原或抗体在组织细胞内的定位分布 缺点 非特异性染色问题尚未完全解决 结果判定的客观性不足 返回 19 建立技术的必备条件 1 荧光素2 荧光素与蛋白质结合物的制备3 荧光检测仪 返回 20 荧光素 可以产生明亮荧光的染色物质 21 荧光的种类自发荧光二次荧光 22 常用的荧光素 返回 23 荧光检测仪 1 荧光显微镜 2 荧光分光光度计 3 流式细胞仪 4 荧光偏振光分析仪 24 荧光显微镜 25 荧光显微镜的构造 26 分类 1 直接荧光法 2 间接荧光法 3 流式细胞术 flowcytometry 样品 细胞 经各种荧光素标记的不同抗体染色后可同时分析细胞表达的多种分子 27 1 免疫荧光法 直接法 简单 快速 特异 敏感性差 将荧光素标记在特异性抗体上 直接检测抗原 28 返回 29 间接法 可检测多种不同的抗原抗体复合物 具一定通用性 敏感性高 但操作流程长 干扰因素多 将荧光素标记在第二抗体 抗抗体 上或标记在SPA上 检测与抗原结合的特异性抗体 30 31 补体荧光染色法 将荧光素标记在补体的抗体上 抗C3抗体 检测抗原抗体复合物 可检测所有的抗原抗体系统 具通用性 敏感性高 但操作流程长 干扰因素多 非特异性荧光多 补体易失活 需新鲜制备不方便 32 33 34 特殊染色法 双标记免疫荧光技术 双色免疫荧光技术 反衬染色法 返回 35 双标记免疫荧光技术 在同一标本中 可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行免疫荧光染色 同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同类型的抗原 如 FITC 黄绿色荧光 和RB200或TRITC9 桔红色荧光 36 双色免疫荧光技术 如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI 碘化丙锭 37 双重染色标本的单色和双色观察 WU WIB DUALBAND WIBA WIG WIB DAPI FITC FITC PI 38 多重染色标本的多色观察 FITC TexasRed DAPI 返回 39 40 反衬染色法 是用一种非特异染色来反衬一种免疫荧光试剂的特异性染色 如 用RB200标记牛血清白蛋白作为非特异性反衬标记 用FITC标记特异性抗体 41 42 流式细胞术 FlowCytometry FCM 是七十年代发展起来的高科学技术 它集计算机技术 激光技术 流体力学 细胞化学 细胞免疫学于一体 同时具有分析和分选细胞功能 它不仅可测量细胞大小 内部颗粒的性状 还可检测细胞表面和细胞浆抗原 细胞内DNA RNA含量等 在血液学 免疫学 肿瘤学 药物学 分子生物学等学科广泛应用 43 44 FACS组成示意图 Fluorescence activatedcellsorter FACS 46 流式细胞仪实验原理 47 48 表达量检测 49 细胞凋亡研究 PI染色 50 AV PI双染色 51 血液学应用 包括DNA倍体分析及细胞周期分析 淋巴细胞亚群测定 白血病免疫分型 淋巴瘤免疫分型 红细胞疾病诊断 血小板功能分析和血小板病诊断 微小残留白血病检测 白细胞吞噬功能测定 NK和LAK细胞活性测定 造血干 祖细胞测定等 52 胞内细胞因子的检测 53 T细胞亚群分析 54 第三节免疫酶技术 enzymeimmunoassaytechnique 1971年Engrail和Penlmann以及Vanweemen和Schuurs两组学者分别用酶代替放射性同位素制备了酶标记试剂 创立了酶免疫分析技术 enzymeimmunoassay EIA 55 第三节酶免疫测定法 enzymeimmunoassay EIA 酶免疫技术是通过适当的酶促化学反应和免疫反应 使抗体 或抗原 与酶蛋白分子结合 形成酶标抗体 或抗原 该结合物保留免疫学活性的酶活性 因而既有抗原抗体反应特异性 又有酶促反应的特异性 酶分解底物后的显色深浅可反映标本中抗原或抗体的含量 常用酶 辣根过氧物酶 碱性磷酸酶 常用方法 酶联免疫吸附试验 ELISA 56 一 原理 E 酶 S 底物 P 有色产物 D1 供氢体 D2 D1的氧化型有色化合物 将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术 57 优点 灵敏度高 特异性强 可定性 定量检测可溶性抗原和抗体 试剂稳定 保存时长 无同位素污染 可肉眼半定量 也可仪器 低廉 定量检测 操作简便 易于掌握和使用 且重复性好 可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分 缺点 标记反应较难掌握 在操作过程中容易引起酶 抗原或抗体的失活 58 建立技术的条件 1 标记酶2 免疫酶结合物的制备3 酶标检测仪 59 常用的标记酶 辣根过氧化物酶 horseradishperoxidase HRP 碱性磷酸酶 alkalinephosphatase AP 葡萄糖氧化酶 glucooxidase Glu D 半乳糖苷 D galactosidase D Gal 60 61 62 二 基本类型 均相酶免疫测定法酶增强免疫技术 酶减弱免疫技术 辅基标记技术2 非均相酶免疫测定法ELISA 直接法 间接法 夹心法 竞争法 抗酶抗体法 1971年建立 称为酶联免疫吸附剂测定 enzymelinkedimmunosorbentassay ELISA 63 直接ELISA 间接ELISA 用于检测Ab 64 directELISA forAg 65 directELISA forAb 返回 66 67 68 返回 69 3 夹心法 sandwichassay 70 夹心法 71 双夹心法 返回 72 73 74 ELISA 双抗体夹心法 测Ag 间接法 测Ab 加Ab 清洗 加Ag形成复合物 洗涤 加该Ag的另一Ab 酶标 洗涤 加底物 读数 加Ag 清洗 加Ab形成复合物 洗涤 加酶标二抗 加底物 读数 聚苯乙烯微量反应板 75 76 抗酶抗体法 PAP 77 血清IgE的检测 实验材料酶标板 聚苯乙烯微量板 马抗人抗体 购自北京中山公司 辣根过氧化物酶 标记的马抗人抗体 待检血清包被缓冲液 碳酸钠碳酸氢钠洗涤液封闭液 溶液反应终止液 78 实验方法包被酶标反应板 加马抗人抗体 孔 孵育小时后洗涤次 分钟次 孔 过夜孔 孵育后 洗涤同上酶标记抗体 加入适当稀释度的酶标抗体 孔 孵育后 洗涤同上底物 加入 邻苯二胺 溶液 孔 室温分钟终止液 加入 孔 内 用酶标仪测定各孔值 测定波长实验结果用待测标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均吸收值的比值 表示 当大于某一数值时 如 判断为阳性 数值的大小依具体检测要求而定 79 4 竞争法 a 固相抗体竞争法b 固相抗原竞争法 80 a 固相抗体竞争法 81 b 固相抗原竞争法 返回 82 夹心ELISA 竞争ELISA 用于检测大分子Ag 用于检测小分子Ag 83 返回 5 抗体桥联法 immunobridge 84 6 抗酶抗体法 peroxidase antiperoxidase PAP 85 PO抗PO法 返回 86 酶联免疫斑点法 enzymelinkedimmunospot ELISPOT 在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法 ELISA 检测体液中游离的细胞因子 CK 或抗体 但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同 使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合 而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平 80年代 国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术 ELISPOT 因其具有较高的特异性和敏感性 目前正被国内外广泛应用 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义 87 88 ELISPOT ELISA ELISA通过显色反应 在酶标仪上测定吸光度 与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量 ELISPOT通过显色反应 在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点 可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数 1个斑点代表1个细胞 从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率 某些研究不仅要测细胞因子生成量 还需检测分泌此细胞因子的细胞频率 由于是单细胞水平检测 ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏 能从20万 30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞 捕获抗体为BD R D Mabtach生产的高亲和力 高特异性 低内毒素单抗 在研究者以刺激剂激活细胞时 不会影响活化细胞分泌细胞因子 89 原理 细胞受到刺激后局部产生细胞因子 此细胞因子被特异单克隆抗体捕获 细胞分解后 被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合 其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合 BCIP NBT底物孵育后 PVDF孔板出现 紫色 的斑点表明细胞产生了细胞因子 通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果 90 DirectandIndirectElISPOT 可在已包被抗体的孔中直接刺激细胞 直接法 或在24孔板或烧瓶中先刺激细胞 然后放入已包被的孔中 间接法 方法选择基于 1 检测细胞的类型 2 希望得到的细胞量 若只需少量的细胞因子生成细胞 使用直接法 反之 最好使用间接法 其它步骤一致 91 ElISPOT操作过程 92 93 94 95 操作过程 1 用100ul70 酒精孵育PVDF孔板 室温下孵育10分钟 2 倒去酒精 用100ulPBS洗涤3次 3 将100ul捕获抗体加入10mlPBS中 混合 每孔加100ul 盖上板盖 4 过夜 4 倒去液体 100ulPBS洗涤一次 5 每孔加入100ul2 脱脂乳PBS 见试剂准备 盖上板盖 室温下孵育2小时 6 在水槽边和吸水纸上轻打 倒去液体 7 用100ulPBS洗涤一次 8 每孔加入100ul细胞悬浮液 含适当量的细胞和相应浓度的刺激剂 细。