ELISAELISA检测技术检测技术 第1页，共25页 ELISA 技术 酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附测定( (Enzyme-linked Immunosorbent Assay，，ELISA) )，，是是利用抗体分子能与抗原分子特异性利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白分离，并利用于固相载体的目的蛋白分离，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法一种检测方法第2页，共25页 ELISA 技术的三个基本原理•抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面，抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性；并且保持其免疫活性；•抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性和酶活合物，同时保持各自的免疫活性和酶活性；性；•酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确定免疫能通过加入底物的颜色反应来确定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。
相应抗原或抗体的量成正比第3页，共25页 ELISA 的分类、原理和操作n竞争法竞争法原理：通过原理：通过a组和组和b组显色的差异，来确定标组显色的差异，来确定标本中待测蛋白的量本中待测蛋白的量加酶标记抗原加底物显色第4页，共25页 优点：优点：1、待测抗原只需一个免疫结合位点，适、待测抗原只需一个免疫结合位点，适合小分子抗原如激素和药物之类；合小分子抗原如激素和药物之类；2、操作步骤简单快捷，只需一个保温洗、操作步骤简单快捷，只需一个保温洗涤过程缺点：缺点：1、酶标记抗体的用量大；、酶标记抗体的用量大；2、定量检测的灵敏度和重复性存在不足定量检测的灵敏度和重复性存在不足第5页，共25页 ¡双抗夹心法双抗夹心法双抗夹心法双抗夹心法改良双抗夹改良双抗夹心法心法第6页，共25页 优点：优点：1、待测抗原需要两个或两个以上、待测抗原需要两个或两个以上的免疫结合位点，所以适合大分子抗的免疫结合位点，所以适合大分子抗原的检测，一般在分子量原的检测，一般在分子量5000D以上；以上；2、由于增加了一层抗体，提高了、由于增加了一层抗体，提高了特异性检测的灵敏度，尤其是改良的特异性检测的灵敏度，尤其是改良的双抗加心法；双抗加心法；3、重复性提高。
重复性提高缺点：缺点：1、操作复杂，费时费力操作复杂，费时费力第7页，共25页 l抑制性测定抑制性测定第8页，共25页 l间接法测抗原间接法测抗原 此方法操作简单、迅捷但重复性一般较差；通常用于此方法操作简单、迅捷但重复性一般较差；通常用于抗体效价的测定和某些疾病的早期诊断抗体效价的测定和某些疾病的早期诊断第9页，共25页 第10页，共25页 ELISA的操作要点的操作要点o样品的保存样品的保存o试剂的准备试剂的准备o加样加样o固相载体固相载体o包被包被o洗涤洗涤o封闭封闭o保温保温o显色和比色显色和比色第11页，共25页 样本提取与保存样本提取与保存 1）在在5 5天内测定的血清标本可放置于天内测定的血清标本可放置于4℃4℃，超过一周，超过一周测定的需测定的需-80℃-80℃冰存 2 2）取约）取约0.3-0.4g0.3-0.4g转基因水稻样品，加转基因水稻样品，加500-500-1000μlPBS1000μlPBS缓冲液，用研钵磨碎，将研磨液转入缓冲液，用研钵磨碎，将研磨液转入EppendorfEppendorf管中，管中，10000rpm10000rpm，，4℃4℃离心离心10min10min，取上，取上清备用。
清备用 最佳取样时间为水稻分蘖期，取样时不同植株应最佳取样时间为水稻分蘖期，取样时不同植株应取自同一部位的样品；该样品依所携外源基因不同取自同一部位的样品；该样品依所携外源基因不同其存放时间不同；如其存放时间不同；如BTBT水稻样品可存放于水稻样品可存放于-20℃-20℃三三个月，个月，-80℃-80℃半年以上在提取样品的过程中，装半年以上在提取样品的过程中，装入样品研磨液的入样品研磨液的BfBf管应置于冰浴中；上清应置于管应置于冰浴中；上清应置于4℃4℃，最多只能存放，最多只能存放4 4天天第12页，共25页 试剂的准备试剂的准备 ELISAELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的；用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的； 自配的缓冲液应用自配的缓冲液应用pHpH计测量较正；计测量较正； 从冰箱中取出的试验用试剂应待温度从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用；与室温平衡后使用； 最好现配现用最好现配现用第13页，共25页 ELISAELISA的固相载体的固相载体 最常用的是聚苯乙烯聚苯乙烯具有较强的吸附最常用的是聚苯乙烯。
聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能蛋白质的性能 国际上标准的微量滴定板为国际上标准的微量滴定板为8×128×12的的9696孔式 在实验前，必须经紫外射线照射在实验前，必须经紫外射线照射1~2小时后，其小时后，其对免疫球蛋白的吸附性能增加对免疫球蛋白的吸附性能增加 已包被抗原或抗体的固相载体在低温（已包被抗原或抗体的固相载体在低温（2-8℃2-8℃）干）干燥的条件下一般可保存燥的条件下一般可保存6 6个月个月第14页，共25页 包被的方式包被的方式¡ 定义：将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包定义：将抗原或抗体固定在固相载体的过程称为包 被，被，¡ 抗体和蛋白质抗原一般采用抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，的碳酸盐缓冲液作为稀释液，¡ 在在ELISAELISA板孔中加入包被液后，在板孔中加入包被液后，在4-8℃4-8℃冰箱中放置过夜，冰箱中放置过夜，37℃37℃中保温中保温2 2小时被认为具有同等的包被效果小时被认为具有同等的包被效果¡ 包被的最适当浓度随载体和包被物的性质及酶结合物的浓包被的最适当浓度随载体和包被物的性质及酶结合物的浓度协调选定。
度协调选定 第15页，共25页 加样加样¡ 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物加酶结合物，加底物¡ 加样时应将所加物加在加样时应将所加物加在ELISAELISA板孔的底部，板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡产生气泡¡ 加标本一般定量多道加液器，使加液过程加标本一般定量多道加液器，使加液过程迅速完成迅速完成第16页，共25页 封封 闭闭 1）定义：是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包定义：是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程被的过程 2 2）目的：抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体）目的：抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在填这些空隙，从而排斥在ELISAELISA其后的步骤中干扰物质的再吸其后的步骤中干扰物质的再吸附 3 3）常用试剂：实验室用的封闭剂是）常用试剂：实验室用的封闭剂是2%2%的牛血清白蛋白。
包的牛血清白蛋白包被好的被好的ELISAELISA板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存板干燥后放入密封袋或锡袋中，在低温可保存数月第17页，共25页 洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISA过程过程中虽不是一个反应中虽不是一个反应步骤，但却也决定步骤，但却也决定着实验的成败着实验的成败聚苯乙烯等塑料对蛋白聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的而质的吸附是普遍性的而在洗涤时可清除在反应在洗涤时可清除在反应过程中非特异性地吸附过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质于固相载体的干扰物质洗涤时可清除残留在洗涤时可清除残留在板孔中没能与固相抗板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质原或抗体结合的物质第18页，共25页 洗涤方式（浸泡式洗涤方式（浸泡式））a. 甩干孔内反应液；甩干孔内反应液；b.b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去）；即甩去）；c.c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置3 3分钟，间分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；d. d. 甩去液体后在吸水纸上拍干；甩去液体后在吸水纸上拍干；e.e.重复操作重复操作c c和和d d，洗涤，洗涤3 3次。
次第19页，共25页 保保 温温 1 1）在）在ELISAELISA中抗原抗体反应的完成需要中抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育 2 2）温育常采用的温度有）温育常采用的温度有43℃43℃、、37℃37℃、、室温和室温和4℃4℃（冰箱温度）等冰箱温度）等 3 3）保温时为避免蒸发，板上应加盖，）保温时为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔第20页，共25页 显色和比色显色和比色¡显色是显色是ELISAELISA中的最后一步温育反应，此中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物生成有色的产物时酶催化无色的底物生成有色的产物¡ 在定量测定中，加入底物后的反应温度在定量测定中，加入底物后的反应温度和时间应按规定力求准确定性测定的显和时间应按规定力求准确定性测定的显色时间一般不需要严格控制及时判断色时间一般不需要严格控制及时判断¡ 比色使用酶标比色仪在比色使用酶标比色仪在405nm405nm波长读数波长读数¡若要终止反应，以防反应过度，常用的碱若要终止反应，以防反应过度，常用的碱性磷酸酶反应终止液为性磷酸酶反应终止液为1M NaOH,1M NaOH,每孔每孔100ul100ul。
第21页，共25页 标准曲线建立样品10μl+990μlPBSBradford法测定样品中可溶性蛋法测定样品中可溶性蛋白浓度白浓度100μl混合液+1000μlG-250紫外分光光度计、595nm依标准曲线测定测定值*100＝样品总蛋白浓度用用牛牛血血清清白白蛋蛋白白（（BSABSA））建建立立分分别配配制制5 5、、1010、、1515、、2020、、3030、、5050、、8080、、100100、、140140（（μg•ml-1μg•ml-1））的的标准准蛋蛋白白溶溶液液（（用用PBSPBS配配制制））系列第22页，共25页 ELISA测定数据的处理测定数据的处理 ①根据标准根据标准Bt蛋白的量和其所蛋白的量和其所对应的对应的OD值计算出其回归值计算出其回归方程②②将所测定样品的将所测定样品的OD值代入值代入回归方程计算出相应的回归方程计算出相应的Bt的量③③根据样品中根据样品中Bt的量和可溶性的量和可溶性蛋白的浓度计算蛋白的浓度计算Bt占可溶性占可溶性蛋白的相对比例蛋白的相对比例第23页，共25页 第24页，共25页 Thank youThank you！！ Any questions? Any questions?第25页，共25页。