血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳 【目的】 1. 掌握血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳的原理 2. 掌握电泳对血浆脂蛋白分类方法、类型 3. 了解血浆脂蛋白的性质、特点 【原理】 1.琼脂糖（agarose）是经过挑选，以质地较纯的琼脂（agar）作为原料而制 成的琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物琼脂胶是一含有硫酸根 和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质会给电泳及凝胶过滤以不良的影 响琼脂糖是直链多糖，它由 D-半乳糖和 3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列 组成 琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶电泳时因凝胶含水量大（98%～99%） ， 近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故电泳速度快，区带整齐而且由于 琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响少，是一种较好的电泳材料，分离效果好 血清中脂类物质是与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形 式存在各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小也 相差很大，因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开 来 琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单 将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑 （或 油红等）进行预染。
再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中，通电后可 以看到脂蛋白向正极移动，并分离出几个区带 2. 血清脂蛋白分类 正常人血清脂蛋白可出现三条区带,从阴极到阳极依次 为 β-脂蛋白(最深)、前 β-脂蛋白(最浅)、α-脂蛋白(比前 β-脂蛋白略深些),在原点 处应无乳糜微粒有时前 β-脂蛋白也显示不出来 按照电泳分类法从前往后依次为： （+）α-脂蛋白，前 β-脂蛋白，β-脂蛋白和乳糜颗粒（-） 3.血清脂蛋白电泳的实质是对血清中的蛋白质进行琼脂糖电泳，并不仅仅是 对脂蛋白进行的电泳，但由于苏丹黑染料只对染疏水性的脂类物质，脂蛋白中含 有大量脂类，因此电泳的结果显示的只是脂蛋白染色带脂蛋白在血清中含量及 其脂类物质的组成量不同，染色结果带的宽窄、颜色深浅均不同 【操作方法一】 1、 血清制备 空腹抽取正常人的血， 迅速移至离心管中， 室温放置 1h 左右， 3000r/min 离心 10 分钟，取血清 注意：雪中加抗凝剂离心得到的为血浆 2、预染血清 取 10ml 血清和 1ml 苏丹黑染色液混合，置于 37℃水浴染色 30 分钟,2000r/min 离心 10 分钟，取上层溶液，下层残渣弃去。
注意：如染色不行，可过夜 3、制备琼脂糖凝胶板 取 1g 琼脂糖，加凝胶缓冲液 200ml，微波炉高温融 化,冷却至 50～60℃时，用吸管吸取胶液浇注载玻片不要使其溢出即可，静止至 凝固态 4、点样 将剪好的滤纸条对折，用手捏一捏折痕，使其锋利，距凝胶边缘 2 厘米的地方切一狭缝，用毛细管黏取羽然好的血清点在切口处，稍等片刻 5、电泳 将凝胶板平行放入电泳槽中,两端搭上湿润的纱布，接上电源，每 板电流 3～4mA，直至脂蛋白分出清晰条带为止 【操作方法二】 1、凝胶制备 参照下表比例并适当增减，称量琼脂糖，转入三角坪（没有广 口瓶的情况下）或广口瓶内，加入 TAE 或 TBE，用微波炉或沸水浴中融化 注意：熔化后不要马上开盖，以防水分蒸发，升高凝胶浓度 琼脂糖 0.1g 0.2g 0.4g 0.8g TAE或 TBE 20ml 40ml 80ml 160ml 凝胶浓度 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 2、用胶带封住电泳槽两端，插入梳子，水平放置 3、上述凝胶冷却至 50～60℃时导入电泳槽，待凝固后，取出梳子，加入适 量电极缓冲液使胶板浸没在缓冲液下大约 1mm 处 注意：拔梳子时要小心 4、样品制备与加样：依据每齿孔大小用微量加样器可加样 5～50μl 不等。
注意：样品加在阴极（-） （黑色） ，一般位于右侧 5、恒压电泳：一般电压为 5～15V/cm对大分子的分离可用电压 5V/cm 直至脂蛋白分出清晰条带为止 【试剂】 1.血清 注意：新鲜的与长期存放的血清，脂蛋白组成不同 2.苏丹黑 将 2g 苏丹黑 B 驾到 60ml 吡啶和 40ml 醋酸酐，混合，放置过夜， 再加 3000ml 蒸馏水，乙酰苏丹黑即析出，至布氏漏斗中抽滤，再将滤出结晶物 溶于丙酮，蒸发丙酮，得乙酰苏丹黑粉末结晶，将乙酰苏丹黑粉末溶于无水乙醇 中，使其成为饱和溶液 3.电极缓冲液 称取巴比妥安钠 30.8g、巴比妥 5.52g 及 EDTA 0.29g，加蒸馏 水至 2000ml 4.凝胶缓冲液 称取 2.42g、NaCl 11.7g 及 EDTA 0.58g，用蒸馏水稀释至 2000ml 5.琼脂糖凝胶 按下表比例配制，用微波炉或沸水浴中融化 琼脂糖 0.1g 0.2g 0.4g 0.8g …… TAE 或 TBE 20ml 40ml 80ml 160ml …… 凝胶浓度 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 0.5% 【器材一】 1.电泳槽 2.纱布 3.载玻片（凝胶板） 4. 毛细管 5. 电泳仪 6.滤纸条 【器材二】 1.电泳槽 2.电泳仪 3.梳子 4.10～50μl 的微量加样器 【思考题】 1.饭后马上取血染色，电泳后，可观察到脂蛋白有几种类型？ 2.长期存放的血清电泳脂蛋白能分几条带?为什么？ 3.为什么β-脂蛋白比α-脂蛋白染色深？ 。