试验五 小鼠肝匀浆T-SOD测定一． 目的掌握动物脏器T-SOD测定的方法；熟悉掌握T-SOD的概念及意义二． 方法及原理羟胺法：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O2－·），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力三． 主要试剂及仪器T-SOD试剂盒；550nm 的分光光度计；37℃恒温水浴或气浴箱；台式离心机；微量移液器；双蒸水；冰醋酸（分析纯，乙酸浓度≥99.5%）；旋涡混匀器;试剂配制：（1）试剂一：贮备液, 10ml×1 瓶（天冷时或放冰箱会有部分结晶析出，需热水浴溶解后再用） ； 试剂一应用液的配制：用时每瓶 10ml 贮备液加双蒸水稀释至 100ml，4℃保存 1 年 （2）试剂二：液体 10ml×1 瓶，4℃～10℃保存 1 年 （3）试剂三：液体 10ml×1 瓶，4℃～10℃保存 1 年 （4）试剂四：贮备液：350μl×2 支，4℃保存，不可冷冻； 4 号稀释液：10ml×1 瓶，4℃保存 6 个月。
试剂四应用液的配制:用时按贮备液:稀释液=1∶14 比例配制，用多少配多少4℃保存，不可冷冻 [注]：所用吸嘴为一次性吸嘴5）试剂五：粉剂×1 支，用时加 70℃～80℃热双蒸水 75ml 溶解后备用，若加热过程中水分蒸发减少，此时必须用双蒸水补充至 75ml，配好后的试剂避光 4℃冷藏1年6）试剂六：粉剂×1 支，用时加双蒸水 75ml 溶解后备用，配好后试剂避光 4℃冷藏保存 6 个月 （7）显色剂的配制：按试剂五:试剂六:冰乙酸=3:3:2 的体积比配显色剂，用多少配多少，配好的显色剂 4℃避光冷藏 3 个月[注]：1.冰醋酸（分析纯，乙酸浓度≥99.5%） 2.试剂五、试剂六必须分开进行配制(切不可将试剂五、试剂六混合后再进行配制),否则不显色四． 操作步骤操作表：试剂测定管对照管试剂一应用液（ml）1.01.0样品（ml）A*双蒸馏水（ml）A*试剂二（ml）0.10.1试剂三（ml）0.10.1试剂四应用液（ml）0.10.1用漩涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟显色剂（ml）22混匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，双蒸水调零，比色最佳取样量A的确定方法：（1）最佳取样量的确定：分别以我们举例的取样量为中间值再加 10μl 及减少 10μl 做三只样本管及一只对照管按操作表进行预试验，以确定最佳取样量。
2）最佳取样量的计算：（对照管吸光度-测定管吸光度）÷对照管吸光度（3）最佳取样范围：应该在 0.15～0.55 之间，即百分抑制率在 15～55%之间（4）此段曲线基本呈正比曲线关系）5）最佳取样量的选择：取百分抑制率在 45%～50%左右的这一管的取样量作为最佳取样量6）最佳取样量的调整：若百分抑制率大于 60%时（曲线为平坦部分），则需将样品浓度稀释或减少取样量后再测试若百分抑制率小于 20%时，则需将样品量加大后测试最佳取样量参考值：1%组织匀浆30—50ul；五． 计算:定义：每毫克组织蛋白在1ml反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位（U）*mgprot为毫克蛋白数六． 注意事项1. A*代表样本取样量和双蒸水取样量2. 最佳取样量因样品种类不同，其 SOD 活力不一根据酶的百分抑制率与酶的活力呈抛物线关系 (附录：SOD 标准曲线) ，各种测定样品取样量不一样，在每测定一种新的样品前最好选择一个最佳取样量。