酶分子定向进化酶分子定向进化酶分子定向进化酶分子定向进化Directed evolution enzymeDirected evolution enzyme酶分子定向进化酶分子定向进化 酶分子定向进化又称为酶分子体外进化，属酶分子定向进化又称为酶分子体外进化，属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略，于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略，是在试管中模拟达尔文进化的过程，利用分子生物是在试管中模拟达尔文进化的过程，利用分子生物学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵敏的学手段在分子水平创造分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体与传统的理性筛选技术，迅速得到理想的突变体与传统的理性设计相比，它不需事先了解蛋白质的空间结构、活设计相比，它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，产生基因多组和自然选择），在体外改造酶基因，产生基因多样性，并结合定向筛选（或选择）技术，获得具有样性，并结合定向筛选（或选择）技术，获得具有某些预期特征的改构酶。
某些预期特征的改构酶 生物的自然进化生物的自然进化进化过程： 突变突变自然选择自然选择遗传后代遗传后代进化结果： 基因多样性基因多样性：为完成同一功能所表现出的：为完成同一功能所表现出的 多个多个 基因或同一个基因基因或同一个基因(同源性同源性) 代谢途径的多样性代谢途径的多样性：同样产物，多条途径：同样产物，多条途径 代谢产物的多样性代谢产物的多样性：同一底物，不同产物：同一底物，不同产物 生物多样性生物多样性：整个生态系统中的生物：整个生态系统中的生物酶的定向进化酶的定向进化酶分子的合理设计酶分子的合理设计(rational design)(rational design)酶分子的定向进化酶分子的定向进化(directed (directed evolutionevolution) )酶的合理酶的合理设计设计体外定向进化的意义体外定向进化的意义理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件的基本先决条件所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制的条件，模拟自然进化机制( (随机突变、重组和随机突变、重组和自然选择自然选择) )，在体外改造酶基因，并定向选择出，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。
所需性质的突变酶酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力医药等领域逐渐显示其生命力定向进化的原理定向进化的原理在待进化酶基因在待进化酶基因的的PCRPCR扩增反应中，利用扩增反应中，利用TaqTaq DNA DNA聚聚合酶不具有合酶不具有3 3-5-5校对功能的性质，配合适当条校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶优化酶( (或蛋白质或蛋白质) )，从而排除其他突变体从而排除其他突变体定向进化的基本规则是定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体获取你所筛选的突变体”定向进化定向进化定向进化定向进化= = = =随机突变随机突变随机突变随机突变+ + + +选择选择选择选择。
前者是人为引发的，后前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的整个进化过程完全是在人为控制下进行的DNADNA改组和外显子改组改组和外显子改组DNADNA改组改组（DNA shufflingDNA shuffling）又称有性又称有性PCR(sexual PCR)PCR(sexual PCR)，原理 该策略的目的是创造将亲该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶通过异，最终获取最佳突变组合的酶通过DNADNA改组改组, , 不不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的仅可加速积累有益突变，而且可使酶的2 2个或更多的个或更多的已优化性质合为一体已优化性质合为一体外显子改组（外显子改组（exonexon shuffling shuffling）类似于类似于DNADNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。
在自然界中，不同分子的内者尤其适用于真核生物在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一与生新蛋白质的有效途径之一与DNADNA改组不同，外显改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNADNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上改组不受任何限制，发生在整个基因片段上定向进化的选择策略定向进化的选择策略1 1、定向进化中，突变具有随机性，但通过、定向进化中，突变具有随机性，但通过选选择特定方向的突变限定了进化趋势择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控，加之控制实验条件，限定突变种类，制实验条件，限定突变种类， 降低突变率，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度2 2、通常、通常, ,筛选方法必须灵敏筛选方法必须灵敏, ,至少与目的性质至少与目的性质相关相关另有一些其他的筛选方法，如加入能另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。
的荧光性质等高通量的筛选体系高通量的筛选体系酶酶性质性质突变方法突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCR-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN稳定性 盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组 胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组酶的体外定向进化应用实例酶的体外定向进化应用实例回本章目录分子进化工程的种类分子进化工程的种类人工获取新基因的方法人工获取新基因的方法常规的基因工程方法 生物功能生物功能 蛋白质蛋白质 基因基因新基因的理性设计和人工合成 根据已有基因的序列和功能进行设计根据已有基因的序列和功能进行设计基因的直接进化（directed evolution) 可使已有基因获得新的特性可使已有基因获得新的特性 可获得自然界中不存在的基因可获得自然界中不存在的基因 可解决许多新的理论和应用问题可解决许多新的理论和应用问题基因直接进化的用途基因直接进化的用途提高酶活性提高酶活性天门冬氨酸氨基转移酶活性提高天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30倍倍改变底物特异性和对映异构体选择性改变底物特异性和对映异构体选择性 酯酶可水解非天然酯类酯酶可水解非天然酯类改善酶的工艺性改善酶的工艺性冷适应和热适应酶冷适应和热适应酶改变酶的拓扑结构改变酶的拓扑结构二体酶变为单体酶二体酶变为单体酶获取许多新的理论知识获取许多新的理论知识基因直接进化的用途基因直接进化的用途提改变酶的特性提改变酶的特性-多功能或单功能酶多功能或单功能酶高酶活性高酶活性-天门冬氨酸氨基转移酶活性提高天门冬氨酸氨基转移酶活性提高30倍倍改变底物特异性和对映异构体选择性改变底物特异性和对映异构体选择性-酯酯酶可水解非天然酯类酶可水解非天然酯类改变酶的工艺性改变酶的工艺性-冷适应和热适应酶冷适应和热适应酶改善酶的稳定性改善酶的稳定性-二体酶变为单体酶或单二体酶变为单体酶或单体酶变为二体酶体酶变为二体酶获取许多新的理论知识获取许多新的理论知识TLPs 的失活曲线的失活曲线TLP-ste突变蛋白的三维结构突变蛋白的三维结构酶拓扑结构的变化酶拓扑结构的变化蛋白质的耐热机制蛋白质的耐热机制天然耐热蛋白质特性：天然耐热蛋白质特性： 减少内腔体积；引入盐桥束；减少表面积减少内腔体积；引入盐桥束；减少表面积/体积比；体积比；除去氧化还原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去除去氧化还原活性基；埋藏暴露的疏水基；除去-支链氨基酸；除去能脱氨基的氨基酸。
支链氨基酸；除去能脱氨基的氨基酸 所有耐热蛋白质的氨基酸同源性低至所有耐热蛋白质的氨基酸同源性低至36%，最高不，最高不超过超过75%分子进化耐热蛋白质特性：分子进化耐热蛋白质特性： 邻邻-硝基苯酯酶（硝基苯酯酶（p-nitrobenzyl esterase）突变突变体体8g8的了稳定性提高了的了稳定性提高了17 C，但突变的氨基酸数但突变的氨基酸数仅有仅有13个，与天然酯酶同源性高达个，与天然酯酶同源性高达97%基因直接进化的步骤基因直接进化的步骤突变突变 基因突变库的建立基因突变库的建立筛选筛选 基因突变库的活体或离体筛选基因突变库的活体或离体筛选基因复制与遗传基因复制与遗传建立基因突变库的方法建立基因突变库的方法定向诱变： 点突变碱基删除、增补和替换随机诱变： 易错PCR法(Error-prone PCR)v 降低一种dNTP的量（降至5-10）v 加入dITP来代替被减少的dNTPv 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+易错PCR 同序法（consensus approach）v对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较，以一定的标准程序计算出各氨基酸序列的共有序列；v人工合成同序基因后重组表达。
Martin Lehmann等（20002002）把这种方法应用在真菌植酸酶家族设计合成了同序植酸酶基因，并表达出具热稳定性的同序植酸酶真菌植酸酶真菌植酸酶aa序列的同序比较序列的同序比较 同序植酸酶-1的最适温度为71，而亲代植酸酶的最适温度为45-55，增加了16-26, 同序植酸酶-1Tm为78，比亲代植酸酶增加了15-22，而催化性质与大多数亲本植酸酶相似 DNA Shuffling:v外显子、单基因和基因家族的重组装v随机引物延伸法v交错延伸法随机片段活体突变: 线状基因和随机片段共转化酵母细胞基因突变库的筛选方法基因突变库的筛选方法Screening the Library and Selecting the Right Clone 平板分析使抗生素失效的酶类(如头孢菌素酶，b -乳糖酶）提高耐热性易于观察的菌落表型（如菌落颜色等）营养缺陷型的辅助筛选 噬菌体展示、细胞表面展示 根据所需要的特性，对经Shuffling后的DNA文库在噬菌体或细菌细胞表面（细菌、纤毛虫细胞表面）的表现特征进行筛选，获得提高目的底物亲和力的突变子。