microRNA的qRT-PCR检测方法（1） 选择内参基因：最好选择U6作为内参，actin 、tublin、5S、EF1-a也可以，最好选择两个内参为参照（两个内参结果更加可靠）2）引物设计：所选基因使用Bencon Designer 软件进行引物设计此软件会把输入的序列和NBCI上的基因做对比，选出特异性的区域自动设计引物，而Primer 5只是在序列上自己设计引物，这样设计可能会有非特异性扩增 Bencon Designer 软件使用步骤如下:打开Bencon Designer--File--New Sequence--粘贴序列--Add--在此方框中选择SYBR Green Design单击符号BLAST Search Sequence--Eukaryotic Genome BLAST--Search（等一会自动生成一个对比结果，可以不用看）--单击Primer Search--Primer Parameters（Tm和Ta为55±5℃、Length 18 to 24bp、Amplicon Length 75 to 200 bp、Alternate Primer Pairs 5）--Search--OK（自动生成Sense和Anti Sense序列，直接可以送公司合成序列）。
3） RNA提取：Trizol法提取植物总RNA，跑1%的琼脂糖凝胶电泳（可以看到small RNA），也可以用热酚法提取小分子RNAOD260/OD280在1.8-2.2之间，OD260/OD230在2.0-2.2之间）4） microRNA反转录：小分子RNA的反转录要买试剂盒，一般分两步，先在小分子RNA后加Ploy A，再就行反转录（按试剂盒步骤操作就可以）5） 以反转录产物为模板稀释3倍、5倍、10倍做qRT-PCR，选择一个合适的稀释倍数（一般microRNA的qRT-PCR不做标准曲线，因为稀释10倍以上Ct值大于35）6） 选择一个合适的稀释倍数，Ct值在20-30之间，溶解曲线为单峰在此阶段最好把处理和对照的内参基因的Ct值都调于接近，这样两者最后做出来的数值可比性数值结果更强7） 实验要平行重复三管，不要重复两个，因为两个重复如果有其一数值偏差大，那么剩下的一个数值也不可以用，重复三管，如果出现一个数值偏差大，剩下的两个还可以取平均值特别是内参，一定要重复三管或四管，如果内参的数值不好，剩下的基因数值再好也没有可比性8） 得到的Ct值做基因相对表达量分析，打开Bio-Rad CFX Manager--打开实验结果--先检查板有没有设好，点击View/Edit Plate--看Target Name是否表上基因名称，Sample Name是否表上样品名称（在做荧光定量的时候就可以标记好）--点击Gene Expression--点击Experiment Settings--点击Targets，在内参基因的Reference上打勾--点击Samples，在对照Control上打勾，选着的对照值将是1--点击OK。
荧光定量PCR仪器操作步骤：打开Bio-Rad CFX Manager--点击File--Open --Protocol--选择PCR程序（我已经设计好mRNA，microRNA的程序，拷到楼下电脑上直接用即可）--Sample Volume写20μl （一般做qRT-PCR总体系为20μl）--OK--Next--Create New--Scan Mode选择SYBR/FAM only--选选放入PCR管的孔所对应方格--Sample Type--选择Unknown--Target Name写上基因名称，SYBR上打勾，Sample Name上写上样品名称，Load打上勾（每个孔都可以这样标记，也可以同时选择多个同时标记）点击OK--保持版面设计--Next--Run（保持结果文件，仪器会自动生成文件名，不需要改动）注意事项：1 操作过程中都要带一次性手套，避免徒手接触荧光定量PCR管操作荧光定量PCR仪器时，放入或取管八链管时都要带手套2定量PCR仪器的OPEN, CLOSE都在电脑上操作，Plate Editor 的Scan Mode选择SYBR/FAM only，这样可以保护仪器，也可以缩短整个PCR过程中的扫描时间。
3 选择准确的移液器，每次就用这套移液器，避免上样量误差4 加模板的时候可以加在PCR管壁上，离心再让模板进入溶液中，这样不用换枪头，速度快，还能减少误差。