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1、荧光定量PCR检测项目,HBV-DNA定量 乙肝基因分型 乙肝拉米夫定耐药 HCV-RNA定量 病毒性脑炎,实时荧光定量PCR 方法 -TaqMan法,方法： TaqMan法 TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有荧光报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,5,3,5,5,3,5,Forward Primer,Reverse Primer,TaqMan Probe,R,Q,Taqman实时PCR的反应过程,
2、Displacement,5,3,5,5,3,5,Forward Primer,Reverse Primer,R,Q,Hydrolysis,5,3,5,5,3,5,Q,R,Polymerization Completed,5,3,5,5,3,5,R,Q,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR 原理 实时原理,常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法
3、对扩增反应实时检测,实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR原理 定量原理,如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值,扩增曲线,荧光阈值,荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进
4、入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值,Ct值,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Ct值的重现性,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,定量原理,理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,定量原理,在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以
5、后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量,标准曲线,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,绝对定量,标本采集和运送,血液标
6、本：用2ml真空采集管或1.5ml高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在2小时内送达实验室（HCV采用EDTA抗凝的血浆）。离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5ml的离心管中。 脑脊液：由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。 用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌和密封 标本采集后，应尽可能快的送至实验室，如运送时间需2小时以上，必须用冰盒送至实验室。 标本中如加入了适当的稳定剂，如用于RNA测定加入4mol/L异硫氰酸胍盐（GITC）的血清（浆）标本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄。 注：RNA采用EDTA
7、抗凝的全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本则尽快（2小时内）分离血清。严禁使用肝素抗凝。,定量检测的临床意义,治疗前进行病毒定量检测，指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。 治疗后定量PCR直接准确地测定体内病毒数量，有助于疗效的判断。 怀孕前进行定量PCR测定，有助于选择有利的怀孕时机。,HBV基因分型,HBV 基因型是根据HBV病毒核酸异源性8% 进行分型 分为A、B、C、D、E、F、G、H等8种 亚洲主要为B型以及C型 感染HBV后的临床经过与不同基因型有关,HBV基因型的临床意义,HBV标志物清除 与B基因型相比，C基因型有更高的HBeAg阳性率，分别为16%与53% 基因型的
8、自发性HBeAg清除要比C基因型早10年，并且在HBeAg清除后，肝脏生物化学指标持续正常。 病毒致病性 HBsAg阳性者中， C基因型比B 基因型的肝功能异常更为常见。C基因型引起的临床表现及组织学损伤更严重。,乙型肝炎的病程及转归 亚洲无症状HBV携带中 ，与B基因型比较,C基因型在肝硬化及50岁以上的肝细胞癌患者中比例较高,而B基因型与50岁以下,特别是35岁以下的肝细胞癌患者有关。 药物敏感性 给予干扰素治疗时，B 基因型的完全应答率达到C 基因型的3倍 HBeAg 阳性乙型肝炎患者使用拉米呋定治疗时, 发现B 基因型患者的HBeAg/ HBeAb 转阴率达到C 基因型的两倍,HBV不
9、同基因型比较,B型 C型 流行性 低 高 HBeAg阳性率 低 高 HBeAg自然清除时间 短 长 HBV DNA 载量 低 高 致病性 轻 重 HCC发生率 低（低年龄组高） 高（高年龄组高） 干扰素治疗完全应答率 高 低 抗病毒治疗效果 好 差 肝癌手术治疗预后 好 差 癌栓栓塞治疗效果 好 差,注意事项,在病毒定量103时,检测基因分型更有意义 可能出现分型结果出现阴性,排除本身病毒量低的原因外,患者HBV基因型可能为非B,C型,HBV拉米夫定,拉米夫定(Lamivudine, Heptodin) “有效”核苷类高效抗乙肝病毒药物，可迅速降低 HBV-DNA的滴度，改善肝脏组织的病变，还
10、可能阻止纤维化的进程，终止肝硬化的发展。 “耐药”长期服用，会引起 HBV 基因突变，造成HBV对药物敏感性大大降低，从而血清中HBV复制恢复活跃，滴度升高。,耐药机理,HBV聚合酶中 Y (酪氨酸） M（蛋氨酸） D（天门冬氨酸） D（天门冬氨酸) 变异毒株的生物特性：对拉米夫定抗病毒效应的敏感性降低至1300，DNA减少仅17。 临床症状：血清 ALT 水平暂时上升，HBV-DNA 的浓度上升, 并有轻度乏力、恶心等肝脏炎症损伤加剧等症状。,I (异亮氨酸） V (缬氨酸）,拉米夫定耐药性,发生率： 治疗慢性乙型肝炎6个月后出现耐药性，在亚洲慢性乙型肝炎病人用拉米夫定 1年，对拉米夫定敏感
11、性降低的病毒变异发生率达14，甚至可达39。 定义：在持续治疗中血清HBV DNA 再现 耐药差异： 检测灵敏度 基础病毒水平 是否多次/多种抗病毒治疗,拉米夫定耐药的临床意义,耐药后的临床情况：发生耐药变异后14个月内虽都有病毒再现，病人的情况也有可能大不相同。 无症状变异病毒携带 部分病人可能只是病毒再现，血清转氨酶持续正常。所以继续服药仍能抑制HBV野生毒株，携带变异毒株因其生活力低，因此并不会发病。 野生毒株转换 有一部分病人停用拉米夫定3-4个月后，变异毒株复制活性低，可能被复制活性较高的野生毒株取代。从而出现野生毒株优势感染，成为慢性无症状病毒携或者肝炎复发。 病变急性加重 发生耐药变异继续拉米夫定治疗的病人ALT增高，多在半年后病变急性加重。 免疫抑制病人发生严重肝损害 预防及处理：治疗6个月后，每3个月检查YMDD和HBV-DNA（尤其是基础病毒水平过高或免疫耐受的病人）,
