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1、GM试验的原理、 操作及应用,客服技术培训中心 2013年8月,目 录,一、侵袭性曲霉菌病 二、GM试验原理及使用方法 三、GM试验的临床应用,曲霉菌,曲霉菌(Aspergillus)是广泛存在于自然界一种腐生菌，孢子较小，直径23um，可在空气中漂浮，可通过呼吸道进入人体。,1 Lin SJ, et al. J Clin Infect Dis, 2001, 32(3): 358-366,多种曲霉菌都可引起侵袭性曲霉病，如烟曲霉、黑曲霉、土曲霉、黄曲霉和构巢曲霉等，90%报道的患者都是由烟曲霉感染所致病1。,烟曲霉,黄曲霉,黑曲霉,侵袭性曲霉患者在血液科和ICU最为常见,1994-1999年法
2、国一项前瞻性流行病学调查结果,Cornet m et al. J Hosp infect. 2002;514:288-296,曲霉菌感染的发生率,相关重点科室：血液科，呼吸科，ICU科，肿瘤科，移植科室等,Teutsch, et al. Clin Infect Dis. 2001, 32: 358,不同基础疾患下侵袭性曲霉感染的死亡率,曲霉菌感染的死亡率,不同诊治情况下侵袭性曲霉感染的死亡率,100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%,死亡率,未能诊断，未治疗,病程10天以上,经验性早期诊治,有效药物治疗,100%,90%,65%,40%,David
3、 W Denning, The Lancet, 2000, February 5 , Vol 355,IFD诊断延迟时间与死亡率的关系,Garey KW et al. Clin Infect Dis 2006, 43:2531,早期诊断和治疗已成为当今医学领域共同关注的重大问题！,临床及影像学表现 病原学证据 无菌部位培养阳性 （培养和非培养方法） 组织病理学阳性 高危患者 拟诊 临床诊断 确诊 预防用药 经验性治疗 抢先治疗 靶向治疗 深部真菌病诊断与治疗策略,曲霉菌的实验室检测方法,涂片：敏感性和特异性均较低。,无菌体液培养：耗时长，阳性率低。,1,3-D-葡聚糖检测： G试验,不能鉴别菌
4、属,半乳甘露聚糖抗原检测：GM试验 曲霉菌抗体检测：抗半乳甘露聚糖抗体检测试验,一、传统方法,二、针对真菌感染标记物的早期快速检测方法,病理切片：取材困难，阳性率低。,金标准,检测曲霉菌属,GM试验被列入真菌诊断和治疗的指南,欧洲癌症治疗研究组织(EORTC) 美国国家过敏症与传染病研究所霉菌病研究组(MSG)批准用于真菌诊断 中国血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则( 第3次修订),GM实验在欧洲已用了十多年， 2003年经FDA认可在美国使用。 有2/3的血液肿瘤患者在其他诊断方法阳性之前6-14d（平均8天）即可检测到GM 抗原【1】 。适于侵袭性曲霉感染的早期诊断。
5、【1】 Maertens J, Van-Eldere J, Verhagen J, et al. Use of circulating galactomannan screening for early diagnosis of invasive aspergillosis in allogeneic stem cell traspants. J Infect Dis,2002,186(9):1297-1306,GM 试验阳性是侵袭性曲霉菌感染诊断标准中重要的微生物学依据 可实现侵袭性曲霉菌感染的早期诊断 可实现对高危人群曲霉菌感染的动态监测 可对抗真菌治疗提供用药依据和进行药效学评价,GM试
6、验的临床意义,侵袭性真菌感染的诊断标准,欧洲癌症研究和治疗组织/侵袭性真菌感染协作组（EORTC/MCG）（2008修订版） 宿主因素 临床表现 微生物学依据 脑脊液隐球菌荚膜多糖抗原阳性确诊 半乳甘露聚糖（GM）试验、G试验临床诊断 组织病理依据,早期诊断,GM试验检测的是半乳甘露聚糖，主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断，是曲霉菌特有的细胞壁成分，当菌丝生长时，半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放，是最早释放的抗原。 GM试验检测早于临床症状和影像学判断【1】： 可比侵袭性曲霉病(IA)临床症状平均早5-8天； 比高分辨CT扫描平均早7.2天； 比开始经验性抗真菌治疗平均早125天。,【1】 P
7、azos C et al. J Clin Microbiol, 2005,43:299-305,为临床用药提供依据,不同病原感染在临床用药方面的差异,曲霉菌:伏立康唑,伊曲康唑, 卡泊芬净,两性霉素-B等 念珠菌: 白色念珠菌: 氟康唑; 非白念: 伏立康唑或卡泊芬净; 卡氏肺囊虫: 复方新诺明、卡泊芬净 毛霉菌: 目前只有两性霉素-B,2012年卫生部对抗菌药物分级管理政策,非限制使用级，如：青霉素，苯唑西林 氟康唑 限制使用级，如：哌拉西林/他唑巴坦 伏立康唑 特殊使用级，如：亚胺培南 卡泊芬净,2012年“专项整治”重点内容,非限制级抗菌药物使用前送检率30% 限制级抗菌药物使用前送检率
8、50% 特殊级抗菌药物使用前送检率 80%,GM试验是真菌送检项目之一，对控制抗菌药物滥用有重要意义。,评价疗效和病情监测,GM释放量与菌量成正比，可以反映感染程度，动态监测血清GM水平的变化有助于判断抗真菌治疗的效果。 在治疗期间,如果病人GM持续阳性或保持较高水平则预后差。 GM抗原清除早的病人预后好，提示连续的血清GM检测能够监测病情变化。,不同患者BG() and GM()体液变化情况,GM试验与疗效评价,GM抗原含量随着抗真菌药物的使用逐渐降低,GM试验原理及使用方法,半乳甘露聚糖（Galactomannan，简写GM）是曲霉菌细胞壁上的一种多聚抗原，其包含了甘露糖骨干与半乳糖旁基的
9、多糖，更准确的一点来说，是直线状（1-4）-D型甘露糖骨架于它们6-连接点连接到-D型半乳糖的多糖，即1-6-连结的-D型吡喃半乳糖。,曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测（GM试验）,获得欧盟CE认证 获得国家SFDA认证,一、酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)技术是以抗原、抗体的特异性结合反应为基础，将抗原或抗体的检测与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的免疫检测技术。 二、按反应方式的不同，ELISA实验的方法分多种。本次推出的真菌抗原和抗体检测产品分别采用了竞争法和间接法。 三、ELISA试验的操作过程由样本处理、加样
10、、孵育、洗涤、显色、终止等几个基本环节组成。各环节的具体要求因产品而异。,ELISA的基本原理,本公司使用竞争ELISA法，其原理是标本中的抗原和酶标板上包被的固相抗原均与试剂中半乳甘露聚糖抗体结合。标本中抗原量含量愈多，与试剂中半乳甘露聚糖抗体结合越多，剩余的抗体与包被抗原结合的越少，抗原抗体结合物与酶标抗体结合的越少，最后的显色也愈浅。 标本和试剂反应后所产生的OD值与标本中待测定的GM含量成反比关系。 通过标准曲线，便可以从反应显色的OD值上计算出待测标本中GM的含量。,曲霉菌半乳甘露聚糖检测（GM试验） 试剂盒使用方法,一、实验前准备 二、样本处理 三、样本混合 四、样本转移 五、洗涤
11、 六、加酶标抗体 七、洗涤后显色 八、读数,开展GM实验需具备的基本条件,单道及多道移液器 高速离心机 酶标仪（450nm波长） 恒温培养箱,GM试验必需仪器设备 1.酶标仪：必须能使用450nm波长用于检测。 2. 高速离心机：必须达到10,000g离心力以上，一般迷你离心机达不到这个离心力的要求。如果离心机不能制冷，可在样本经沸水浴处理之后室温冷却15min再离心。 3. 37恒温培养箱（或其他可替代的恒温空气浴设备）：必须设置温度为37，其他温度（如35）不可以使用，否则会影响检测值，同时要保证恒温箱的洁净。 4. 沸水浴：一般的电磁炉或者其他可以保证沸水浴的设备皆可，但暂不推荐干浴 5
12、. 漩涡混合仪,GM试验必需器具及耗材 1. 100L和300L多道移液器（排枪）及配套吸头：可以减少不同孔的加样时间差。如果使用洗板机，无需用300L多道移液器。 2. 100L和1000L单道移液器及配套吸头 3.配制洗液的量筒和保存洗液的试剂瓶 4.混合板：必须用厂家标配的混合板，可以有效地缩短转移时间 5.加样槽：每种试剂使用专用加样槽加样，使用后清洗干净。 6.封板膜：需用户根据每盒试剂做实验次数自备一部分备用 7.浮漂：沸水浴使用,数据处理软件 厂家提供的配套数据处理软件,推荐耗材： 带锁扣的离心管：密闭性强，可以有效防止沸水浴时，EP管因加热而导致盖子弹开和引入污染。也可以用普通
13、离心管代替，但是注意离心管内液面低于管外液面3mm左右即可，以保证沸水浴时管盖不弹开。,选配仪器：微孔板孵育/振荡器，洗板机，全自动酶免分析仪,推荐设备： 酶标仪： Bio-Tek：Elx808IU, Thermo：Multiskan FC with incubator, Tecan： sunrise RC 2. 洗板机： Bio-Tek Elx50,GM实验操作流程,混合,转移,加酶标抗体,显色,终止,样本采集与保存,一、试验前准备,产品全貌,浓缩洗液20倍稀释，配制洗涤工作液,取出酶标板，根据需要拆分板条,二、样本处理,100L处理液,取300L血清,+,二、样本处理 1. 沸水浴3min
14、,二、样本处理 2. 10,000g离心10min,三、样本混合,60L样本+60L抗半乳甘露聚糖抗体,水平震荡混匀后，37温浴30min。,四、样本转移,将混合液转移至酶标板,贴好封板膜， 37温浴 30min。,转移时各反应孔一一对应！,五、洗涤3次,先甩尽孔中液体,然后在吸水纸上拍干,b. 静置40秒，甩尽孔中液体,c. 在吸水纸上拍干,a. 每次每孔加入300L洗涤液,重复此操作3次 （可使用洗板机完成）,a.每孔加100L酶标抗体,b.贴好封板膜,c. 37恒温30分钟,六、加酶标抗体,七、洗涤后显色,洗板3次 加显色底物 加终止液并用酶标仪读取OD450值,洗涤3次后每孔加100L
15、显色底物,37恒温15分钟后，加入终止液（ 50L /孔）,450nm波长下读数,注意事项（1）,4. 洗涤操作时每孔的加样量应保持一致，拍板时应确保孔内无明显液滴残留。,1. 使用移液器时排液不宜过快，防止溅出孔外，也不宜过慢，以免增大不同样本反应时间的差异（用户一定要使用多道移液器加样；推荐使用抗原检测产品配套耗材混合板）。,2. 处理样品时应沸水浴，否则将影响结果。,3. 严格按说明书要求控制孵育过程的温度及时间，不能随意变动。,试剂、血液样本应在适当的温度下保存，并避免反复冻融。 为了防止污染，请使用洁净无菌的吸头。 配制洗液时要混合充分，并使用无菌去离子水或超纯水。 不能使用洗瓶洗涤酶标板。 试剂盒组分使用前请先取出30min，平衡至室温。 使用校验合格的移液器，移液器与吸头请契合紧密，确保移液精准。 试剂盒中TMB底物溶液（R9）易氧化，尽量缩短开盖时间且避免强光照射，若溶液颜色变为浅蓝色时（正常使用时应为无色），应弃用。 终止液具腐蚀性，易发生灼伤，在操作时请注意人身安全。 各产品同时使用时，除浓缩洗液及终止液外，请勿将同一名称试剂互相替代使用。,注意事项（2）,阴阳性判定,阳性：GM0.95g/L 阴性：GM0.75g/L 灰区：0.75GM0.95g/L，建议连续多次检测并
