《【最新word论文】绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析【药学专业论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【最新word论文】绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析【药学专业论文】（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析作者：陈波曼 余加林 刘官信 胡琳燕 李芳 杨华【摘要】 目的 探讨铜绿假单胞菌细菌生物膜(biofilm，BF)形成发展过程中空间立体结构变化，以及 BF 形成过程中与其生物学行为之间的相互联系。方法 体外建立 6h 和 1、3 及 6d 等 4 个时间组铜绿假单胞菌 PAO1 菌株 BF 模型，通过绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)标记，结合激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)摄取 BF 形成发展各阶段不同层面的图片堆，经图
2、像结构分析软件(image structure analyer，ISA)分析获得 PAO1 菌株 BF 相关空间结构参数定量化数据。结果 CLSM 结合 GFP 标记，实现了对 PAO1 菌株 BF 动态形成过程的观察；ISA 软件定量化分析显示，随着 BF发展，厚度不断增加，前 3d 增加程度(19.6m)明显大于后 3d(6.1m)，区域孔率(areal porosity，AP)、平均扩散距离(average diffusion distance，ADD)和结构熵(textural entropy，TE)在 BF 形成的 6h 和 6d 分别为：0.980.01 和0.920.02，呈现下
3、降趋势；1.000.009 和 1.060.027，虽变化幅度不大，但亦呈现逐渐增加趋势；0.70.08 和 4.30.09，呈明显上升趋势。结论 ISA程序可以表征 PAO1 菌株 BF 的空间结构特征，对细菌 BF 结构的定量化分析也有助于探索 BF 形成过程与其生物学行为之间的相互联系。 【关键词】 生物膜； 铜绿假单胞菌； 定量分析； 结构ABSTRACT Objective To quantify the sequential development of biofilm spatial structure in biofilm process with Image Structur
4、e Analyer (ISA) software, which will provide assistant to further research on the biological behavior of biofilm. Methods P.aeruginosa PAO1 biofilm model in vitro was constructed on glass slice and biofilm development was monitored in different time intervals (6 hours, 1 day, 3 days and 6 days). The
5、 fluorescence images stack of different layer in biofilm model were obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM), based on fluorophores from PAO1 with green fluorescent protein (GFP) genetically tagged. Quantitative parameters describing biofilm spatial structure could be acquired after the
6、 image information was calculated by ISA software. Results The PAO1 biofilm process was investigated successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. The quantitative data from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth, the rate was more obvious durin
7、g the first 3 days than the latter 3 days (19.6m vs. 6.1m); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.980.01 at 6h to 0.920.02 at 6d, the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.000.009 at 6h to 1.060.027 at 6d; the textural 2entropy (TE) increased from 0.70.08 at 6h to 4
8、.30.09 at 6d. Conclusions The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with biofilm performance.KEY WORDS Biofilm; Pseudomonas aeruginosa; Quantitati
9、ve analysis; Structure长久以来，人们对细菌的认识停留在浮游态水平上，但自然界中 99%的细菌以生物膜(biofilm，BF)的形式存在。细菌 BF 是细菌为适应生存环境黏附惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式，具有环境适应能力更强，抵抗吞噬细胞作用，逃避宿主免疫，尤其耐药性极强等生物学特性，而 BF的许多特性均与其特殊形态结构有关。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是我国医院和社区获得性感染及重症监护病房感染的重要条件致病菌，近年来研究证明，该菌极易形成 BF1 ，临床上，有 BF 表型的 Pa 往往引起难以治愈的严重感染
10、。以往研究多采用光镜、扫描或透射电镜等观察细菌BF 结构，但样本在脱水、固定、染色等处理过程中易发生结构扭曲及关系改变。本实验通过建立体外 PaO1 菌株 BF 模型，结合绿色荧光蛋白(GFP)标记技术，运用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)摄取 BF 发展成熟各阶段不同层面的图像，所获图片堆经图象结构分析(image structure analyer，ISA)软件分析，获得 PAO1 菌株 BF 发展过程相关空间结构变化的数据，以期实现对细菌 BF 的无损伤观察，并对 BF 空间结构的定量化分析进行了初步探索。1 材料和方法1
11、.1 试剂和菌株铜绿假单胞菌 PAO1 菌株(本实验室保存)，pGFPuv 质粒(Clontech 公司)，质粒 DNA 小量提取试剂盒(日本 BioFlux 公司)，限制型内切酶 EcoRI 和HindIII(宝生物公司)，ISA 软件(美国 Montana 州立大学 Haluk Beyenal 教授提供)。(1)PAO1 菌株电感受态制备 参考单志英等2实验方法，将过夜增菌的PAO1 菌株转接于 50ml SOB 培养基中，37，200r/min 振荡培养；A600 值为 0.7左右时中止培养；2，6000r/min 离心 15min；菌体沉淀依次用等体积、1/2 体积、1/5 体积的 0
12、.3mol/L 冰浴蔗糖溶液重新悬浮，洗涤菌体；2，6000r/min离心 15min，最后根据菌体多少加入不同体积的 0.3mol/L 蔗糖溶液将菌体混匀；分装成每管 100l，直接用于电转化。(2)pGFPuv 质粒转化和转化菌株筛选 感受态细胞 100l，质粒约 50ng，加入预冷的 0.1cm 电转化杯中；在 BioRad 电转化仪上(设置电压 1.5kv，电容25F，电阻 200)进行电击 5ms；将转化体系加入 37温浴的 800l SOC 培3养基中，37，100r/min 振荡复苏 1h；取 100l 菌液涂布筛选培养基，37，16h18h；在筛选培养基上生长，且紫外灯下有绿色
13、荧光的菌落即为实验需要的转化菌株。(3)转化菌株中质粒提取和酶切电泳鉴定 挑取表达强绿色荧光的转化菌株单菌落，接种 LBroth 培养液，37振荡培养过夜；按照 BioFlux 公司质粒提取试剂盒产品说明进行质粒的小量提取；0.8%琼脂糖凝胶电泳；对照 pGFPuv 质粒图谱进行鉴定。用 EcoRI 和 HindIII 行双酶切，反应温度为 37；反应体系为 HindIII 1l，EcoRI 1l，10M 缓冲液 2l，提取质粒 17l，作用12h；0.8%琼脂糖凝胶电泳。(4)pGFPuv 转化菌株建立 BF 模型 挑取 GFP 转化 PAO1 菌株单菌落接种LBroth 培养液，37，18
14、0r/min 振荡培养过夜；调整 A600 值至 0.5；接种PAO1 菌液于预先放置灭菌盖玻片(8mm8mm，作为黏附载体)的 24 孔细胞培养板中，每孔 1ml；37，分 4 个不同时间段 6h、1d、3d、6d 孵育，隔日换液，每个时间段重复 5 次。1.2 激光共聚焦显微镜观察氩激光(488nm)激发，物镜20，每个模型由外(BF 游离的一面)向内(BF 和玻片相贴的一面)逐层扫描(沿 Z 轴扫描)，每个标本扫描 816 张。1.3 运用 ISA 软件对 PAO1 菌株 BF 结构定量化分析将上述获得的各时间组模型图片堆调入 ISA3D 软件，确认图片的完整性及顺序后运行 ISA 及
15、ISA3D 命令，运行结果包括：结构参数：如结构熵(textural entropy，TE)、结构能(energy，E)、均一性(homogeneity，H)；平面参数：区域孔率(areal porosity，AP)、平均扩散距离(average diffusion distance，ADD)、最大扩散距离(maximum diffusion distance，MDD)等指标；其它参数：如生物量(biovolume，BV)、比表面积(surface area between biomass and void，SA)、单位面积生物膜体积(biomass volume to surface are
16、a ratio，V2SA)等3 。输出数据以 EXCEL 格式保存。2 结果2.1 GFP 标记的 PAO1 菌株构建与发光表型观察通过电转化方法对 PAO1 菌株进行了 pGFPuv 标记。转化菌株自然光下即可见绿色荧光，在紫外灯下发出强绿色荧光；荧光显微镜下，转化菌株菌体发出明亮的绿色荧光，细菌形态呈短棒状，提示 pGFPuv 已经成功转入了 PAO1 菌株中，该转化菌株可以作为 BF 空间结构定量化分析研究的模式菌。2.2 转化菌株质粒提取鉴定及双酶切鉴定4转化菌株抽提质粒后，电泳结果显示在 2000 和 3500bp 之间有一条约3300bp 带，条带与质粒大小吻合。提取的质粒进行 EcoRI 和 HindIII 双酶切，电泳显示在 2000 和 3500bp 之间有一条约 2500bp 带，在 500 和 1000bp 之间有一条约 800bp 带，与预期结果吻合，提示 pGFPuv 已成功转入 PAO1 菌株，并以游离质粒形式表达
