《【最新word论文】细菌的消毒防腐剂耐药基因研究进展【药学专业论文】》由会员分享，可在线阅读，更多相关《【最新word论文】细菌的消毒防腐剂耐药基因研究进展【药学专业论文】（12页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1细菌的消毒防腐剂耐药基因研究进展【摘要】 消毒防腐剂的耐药性已经越来越受到人们的重视，消毒防腐剂与抗生素之间存在的交叉耐药性值得关注。现发现细菌对季胺类和双胍类等消毒防腐剂的耐药性与基因有关。本文对季胺类和重金属等消毒防腐剂耐药基因作一综述。 【关键词】 细菌； 消毒防腐剂； 耐药性； 基因ABSTRACT Antiseptic resistance has arisen more and more attention, and the cross resistance between antiseptics and antibiotics is a great problem we foc
2、us on. Now it is shown that the bacterial resistant to antiseptics such as quaternaryammonium compounds (QACs) and chlorinereleasing agents (CRAs) has relationship with genes. The following article is a review for the progress on the antiseptic resistance gene such as qac and merA.KEY WORDS Bacteria
3、; Antiseptics; Drug resistance; Gene消毒防腐剂在生活中的应用和发展已有几个世纪。从经验性地用铜和银打造的容器来储存饮用水，用醋和蜂蜜清洗伤口，用香料保存鱼和肉，到用碘酒作为伤口消毒剂，在产科中应用含氯水溶液，将苯酚作为伤口敷料以及在外科中作为抗菌剂，和将二价汞离子用作杀芽孢剂，整个消毒防腐剂都处在不断的发展之中。20 世纪初人类又进一步开发了双胍类(CRAs)和季胺类消毒剂(quaternaryammonium compounds，QACs)。到了 20 世纪 40 年代，常用的消毒防腐剂已有酚类化合物、有机汞、双胍类消毒剂、季胺类消毒剂、碘及其复合物、乙醇
4、、甲醛、过氧化氢、银化合物、染料(如吖啶、三苯甲烷)和两性表面活性剂。直到目前，这些消毒剂中的大多数仍在广泛地使用1 。尽管消毒防腐剂一直在更新换代之中，但是在其广泛的选择压力下，细菌仍然渐渐产生了耐药性。因此，又一新的挑战已经摆在医务人员面前。现已发现，细菌对季胺类、双胍类以及重金属等消毒防腐剂的耐药与细菌本身的耐药基因有关。本文对细菌的消毒防腐剂耐药基因研究进展综述如下。1 季胺类消毒剂耐药基因(qac)细菌的季胺类消毒剂耐药基因首先从葡萄球菌属中分离得到。因其编码的蛋白介导对季胺类消毒剂耐药，从而命名来源于此。目前该类消毒剂耐药基因有qacA、qacB、qacC、qacG、qacH、qa
5、cF、qacJ、qacE 和 qacE1。1.1 qacA/BqacA 多重耐药基因 qacA 首先在 20 世纪 80 年代从多重耐药的携带 内酰胺酶和金属离子耐药基因的质粒 pSK5 中分离得到，随后英国和澳大利亚也在2金葡菌和凝固酶阴性葡萄球菌中发现携带 qacA 基因的 pSK1 家族质粒和 pSA1379质粒的流行2，3 ，之后在细菌的染色体上也发现 qacA 基因的存在4 。Rouch 等5研究表明，qacA 基因与四环素耐药基因 tet 和糖转运体基因有高度的同源性。 核酸序列分析表明，qacA 基因编码 514 个氨基酸的多重耐药Mr55017 外排蛋白(QacA)。 该蛋白含
6、有 14 个 螺旋的跨膜片段(transmembrane segments，TMS)，属于主要易化子超家族(the major facilitator superfamily，MFS)，依赖质子泵动力把菌体吸收的药物排到体外，介导对 30 多种结构不同的有机化合物包括单价阳离子化合物(如季胺类化合物和染料)和二价阳离子化合物(如联脒和丙脒腙)耐药6 。经流式细胞仪检测，发现单价和二价阳离子化合物作用在 QacA 蛋白不同靶位上7 。另有研究表明，其中第 10 个 螺旋的跨膜片段是 QacA 蛋白袋状结构域的酶作用底物完整的结合位点，其中 323 天冬氨酸残基和 319 甲硫氨酸残基是二价阳离子
7、化合物的直接结合位点。313 甘氨酸残基被认为在底物转运过程中起了非常重要的作用。通过诱变试验表明，多重耐药 QacA 蛋白的袋状结构域作用位点极易发生适应和突变8 。现在公认，作为 qacA 的上游基因 qacR 所编码的蛋白可抑制 qacA 转录。该蛋白属于 TetR/CamR 转录调控家族，是有 188 个氨基酸，分子量为 22.8ku 的二聚体。TetR/CamR 家族成员具有相似的三螺旋 N 端 DNA 结合结构域和反向的 C 端结构域，这些结构特点能结合特异蛋白形成复合物，而且大多数 TetR/CamR 家族成员结合由 015bp 的 DNA 序列编码二聚体调控子。QacR 能在
8、qacA 启动子区结合一段较长的序列(IR1，包括 28bp)，其覆盖的范围包括 qacA 的转录起始位点9 。QacR 与 IR1 以两个二聚体形式结合，并且 QacR 可能作为抑制因子与 IR1结合形成 DNA 蛋白复合物，阻止 RNA 聚合酶 启动子复合物往前移动生成RNA，而不是阻断 RNA 聚合酶与启动子的结合911 。QacR 蛋白由很多结构不相似的单价和二价亲脂性阳离子化合物诱导产生，这些化合物同时也是 QacA 外排泵酶的作用底物，如果这些化合物的其中之一结合到 QacR 蛋白任何一个二聚体上，将导致 QacR 蛋白由线状到螺旋状转变，最终导致蛋白内部的 92 和 93酪氨酸残
9、基排到蛋白外面，形成药物结合袋状结构域。这些重要的构像变化将导致螺旋 5 的一次延伸，并促使螺旋 6 在 DNA 结合区域易位。螺旋 6 与螺旋1 的 DNA 结合区域有很多复杂的相互作用关系，它的活动可导致 DNA 结构域结合的药物亚基发生平移和旋转，分别为 9.1 和 36.7；游离的药物结合亚基仅发生很小的平移和旋转，分别为 3.9 和 18.3。这些构像变化的结果是使得DNA 识别的螺旋中心距离变大了 9 ，最终导致该结构不再结合到 IR1 的位点上去，使得 qacA 基因开始转录12 。qacB 早在 20 世纪 50 年代，国外学者就已经从澳大利亚的一家医院临床分离的金葡菌中提到携
10、带 qacB 基因的质粒 pSK156，这是最早分离到的已知编码外排泵蛋白的质粒8 。此后，80 年代时又在金属离子高度耐药的质粒 pSK23 中也发现存在 qacB13 。基因测序和诱变试验研究表明，与 qacA 基因相比，两者之间仅仅是 7 个碱基和第十个跨膜片段 323 位的氨基酸不同，qacA 为天冬氨酸，qacB 为丙氨酸，因此不能用 PCR 和 Southern blot 的检测方法对它们进行鉴别。这种差异被认为是由于临床上长期应用二价化疗药物而诱导形成的。现在发现，与 QacA 不同的是，QacB 仅对单价阳离子化合物耐药，对少数的二价阳离3子化合物呈低度耐药8 。1.2 qac
11、CqacC 基因又名 qacD、ebr 或 smr，可从金葡菌小质粒和大质粒如 2.4kb 的pSK89、pSK108 和 47.8kb 的 pSK41 中分离得到13 ；在凝固酶阴性葡萄球菌的结合型质粒 PNVH99 中也发现它的存在14 。后来从食品中分离得到的葡萄球菌经核酸测序证明，qacC 与 smr 仅有一个核苷酸的不同。qacC 基因编码的蛋白含有 107 个氨基酸，属于原核多重耐药家族，这个家族中还包括大肠埃希菌编码蛋白 Ebr 和革兰阴性杆菌的整合子编码蛋白 QacE。该家族的蛋白均有四个跨膜片段，它们依靠质子泵的动力对季胺类化合物和溴化己啶等消毒剂耐药15 。Paulsen
12、等进一步研究表明，QacC 蛋白四个跨膜部分均为 螺旋，四个部分分别由膜外周质的两个区域和膜内的一个区域分隔开来(图 1)。通过定向诱导试验发现，用具有相同侧链的甘氨酸和丙氨酸取代 QacC 蛋白的保守残基 31 脯氨酸、59 酪氨酸和 62 色氨酸，能明显地降低对乙啡啶和甲基玫瑰苯胺的耐药水平。以上现象表明，这些氨基酸应该处在酶特异性结合位点的边缘。而且 59 酪氨酸和 62 色氨酸的替换几乎能降低对绝大多数消毒剂的耐药水平， 因此 59 酪氨酸和 62 色氨酸在酶结合位点起了非图 1 QacC 蛋白模型图常重要的作用16 。1.3 qacGqacG 基因是 1999 年从具有 2.3kb
13、碱基的质粒 pST94 中分离得到的。该基因编码的蛋白 QacG 有 107 个氨基酸，与 Smr、QacE 和 EmrE 的同源性分别是69.2%、45%和 41%，属于小的多重耐药家族(the small multidrug resistance family，SMR)，其耐药机制也是依赖质子的外排泵。与 Smr 蛋白不同的是，QacG蛋白的第 33 号氨基酸被分散地贯穿于整个蛋白，而 Smr 蛋白仅处在第二个 螺旋内。与 Smr 蛋白相同的是，QacG 蛋白的疏水性氨基酸和 Smr 疏水性氨基酸处于相同的位置，具有同样的蛋白折叠结构。这两个蛋白均有两个保守区域，分别是第 38 号氨基酸到
14、 47 号氨基酸和 52 号氨基酸到 71 号氨基酸，这两个区域分别在 Smr 蛋白结构模型中第二个跨膜片段的羧基末端和第三个跨膜片段的氨基末端上。多重氨基酸序列对比研究表明，小的多重耐药家族成员拥有许多的保守序列。在 QacG 蛋白中，大多数残基被认为是保守的，但是有两个例外：9 丙氨酸被替换为丝氨酸和 32 丝氨酸被替换为苏氨酸。与 Smr 蛋白相比，QacG 蛋白中大约一半的氨基酸替换被认为是保守的，包括疏水氨基酸的替换，如亮氨基酸 异亮氨酰基、缬氨酸 异亮氨酸和苯丙氨酸 异亮氨酸。总之，与 Smr 蛋白相比，它的 33 个氨基酸替换并没有使它的耐药谱发生太大的变化。两者均对苯扎氯铵(b
15、enzalkonium chloride，BC)耐药，但是 QacG 却对吖啶变得敏感，而且对磷酸三苯酯、罗丹明 6G、二氨基吖啶、盐酸四环素和联二n 甲基吡啶(MV)始终保持敏感17 。1.4 qacH41998 年，Heir 等从腐生葡萄球菌中分离得到一个 2.4kb 的质粒 p2H6，其中含 qacH 基因。核酸测序结果表明，完整的质粒 p2H6 有一个开放读码框负责编码含 107 个氨基酸的蛋白，并与小的多重耐药家族蛋白有高度同源性。进一步作氨基酸测序表明，QacH 与 Smr、QacG 分别有 78%和 70%的同源性。与 Smr 和 QacG不同的是，QacH 对二氨基吖啶呈低水平
16、耐药，对溴化乙啡啶高度耐药。将 qacH基因克隆到与 qac 相同的质粒上作进一步研究，结果表明，qacH 基因的启动子也是自身内在的基因。由此可见，QacH 与 Smr、QacG 一样，都有广泛的耐药谱。经荧光素标记法显示，QacH 对溴乙啡啶高度耐药也是质子泵所介导的。定向诱变替换试验表明，以 24 谷氨酰胺替换 24 天冬氨酸并不能在耐药特征上产生很大的改变。同时，在 p2H6 质粒上还有另外一个开放读码框来编码一个与滚环复制蛋白类似的未知蛋白18 。1.5 qacJqacJ 基因是 Bjorland 等 2003 年在挪威从马身上的金葡菌分离质粒pNVH01 中得到的。同时，在中间葡萄球菌(S.intermedius)和模仿葡萄球菌(S.simulans)上也发现存在质粒 pNVH01。pNVH01 质粒拥有 2650bp 碱基，是环状DNA 复制机制的 pC194 质粒家族
