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1、1紫菀的毒性部位及对小鼠的急性肝损伤作用研究作者：王蕾，张勉，金晶，黄芳，张朝凤【摘要】目的分离富集紫菀的毒性成分，研究毒性部位的肝脏急性毒性。方法采用柱层析色谱法分离，以小鼠急性毒性为指标，筛选出紫菀的毒性部位，并测定了 LD50。小鼠急性肝脏毒性研究方法主要采用的是血清生化指标(ALT，AST，TBIL)检测和肝组织病理切片检查。结果经硅胶柱层析分离富集，得到紫菀的毒性部位 Fr2，其 LD50 为 0.052g/kg。与对照组比较，单次给药后，LD0 剂量组小鼠血清 ALT、AST 均有显著升高，TBIL 没有显著差异。组织病理学检查结果表明，紫菀毒性部位 LD0 剂量可引起小鼠肝脏轻度
2、细胞水肿，可见肝细胞点状坏死、肝小叶及汇管区见有炎细胞浸润;LD100 剂量下可引起小鼠肝细胞呈不同程度脂肪变性、细胞水肿，可见肝细胞坏死、肝小叶及汇管区均见有炎细胞浸润。结论紫菀毒性部位的 LD50 为 0.052g/kg，单次给药小剂量对小鼠肝脏有轻微损伤，大剂量可引起小鼠较为严重的急性肝损伤并致死。【关键词】紫菀;毒性部位;LD50;急性肝损伤Abstract：ObjectiveTheethylacetate(EtOAc)partof90%ethanolextractofRadixAsteris(RA)showedstrongtoxiceffect(LD500.19g/kg)tomice
3、inourpreviousinvestigation.ThispaperaimedtoobtainarefinedtoxicpartfromtheEtOAcpart,andtoinvestigatetheacutehepatotoxicityofthistoxicparttomice.MethodsThetoxicpartwassearchedbycomparingthetoxicityofthecombinedfractionsthroughthegelsilicacolumnchromatographyusingthedeathofmiceasindex.LD50ofthetoxicpar
4、twasdetermined.Theacutehepatotoxicityofthetoxicparttomicewasmeasuredbybiochemicalindicators(ALT,ASTandTBIL)inserumandhistologicalexaminationofliver.ResultsFr2fractionobtainedfromtheEtOAcpartwasconfirmedasthetoxicpartanditsLD50was0.052g/kg.Theacutehepatotoxictestofthetoxicpartinalowerdose(LD0)showedt
5、hatALT,ASTweresignificantlyincreasedbutTBILhadnoobviouschangesascomparedtocontrolgroup.Histologicalexaminationshowedthatalowerdose(LD0)ofFr2couldinduceslightedemaandspottynecrosisoflivercell,aswellasphlogocyteinfiltration;andahigherdose(LD100)couldinduceseriousliverinjuryinmice.ConclusionThevalueofL
6、D50(0.052g/kg)indicatethatFr2istherefinedtoxicfractionofRA.TheresultsofbiochemicalindicatortestandhistologicalexaminationconfirmedtheacutehepatotoxicityofFr2whichinducedmoreseriousliverinjurytomicegivenahigherdosethangivenalowerdose.Keywords：RadixAsteris;Toxicpart;LD50;Acuteliverinjury紫菀(RadixAsteri
7、s)为菊科植物紫菀 AstertataricusL.f.的干燥根及根茎，辛、苦、温，具有润肺下气、消痰止咳的功效，用于痰多喘咳，新久咳嗽，劳嗽咳血1。历代本草及现代中医药专著均沿袭了其无毒的说法。本课题组前期研2究中发现，紫菀水煎液灌胃给予小鼠有一定的急性毒性和肝脏毒性2;进一步的研究表明，紫菀以 90%乙醇提取毒性最强，通过毒性部位的追踪，发现其醋酸乙酯部位为紫菀的粗毒性部位(LD50 为 0.19g/kg)3。本实验在前期工作的基础上，仍以小鼠急毒为筛选指标，对醋酸乙酯部位进一步细分，得到毒性成分更集中的部位，并首次研究其对小鼠的肝脏毒性。1 材料与仪器1.1 动物昆明种小鼠，雄性，体质量
8、 1822g，由南京青龙山实验动物中心提供。1.2 药物及试剂紫菀购自河北省安国市药材市场，经中国药科大学生药学研究室张勉教授鉴定，凭证标本保存于中国药科大学生药学研究室。提取溶剂为市售 90%工业酒精;石油醚、醋酸乙酯、甲醇、氯仿均为市售分析纯;薄层色谱硅胶及柱色谱硅胶为青岛海洋化工厂生产。谷丙转氨酶测定试剂盒(ALT)，批号：20091112，谷草转氨酶测定试剂盒(AST)，批号：20091112，血清总胆红素测定试剂盒(TBIL)，批号：20091112，均为南京建成生物工程研究所产品。1.3 仪器旋转蒸发仪，瑞士 Buchi 实验仪器公司产品，型号：R-2000;数显恒温水浴锅，国华电
9、器有限公司产品，型号：HH-4;电子天平，型号：PL303，Matter-ToledoGroup;医用数控超声仪，型号：KQ-250DE，昆山超声仪器有限公司产品。高速冷冻离心机，型号：TLG-16，湘仪集团;1500 酶标仪，ThermoElectrom 公司产品。2 方法2.1 紫菀各部位的制备方法紫菀药材粉碎成粗粉，分别用 10，8，8 倍量 90%乙醇回流提取 3 次，每次 1h，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味的稠膏状，加水混悬，依次用石油醚和醋酸乙酯萃取，得到紫菀醋酸乙酯部位。取醋酸乙酯部位浸膏，采用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，各流分根据薄层色谱结果合并，得到 A-1、A-2、
10、A-3 三个部分，各部分均以 1g/kg(浸膏量)给药，给药体积0.2ml/10g，进行急性毒性实验。取 A-2 部位浸膏，采用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，收集各极性段的流分根据薄层色谱结果合并，得到 Fr1、Fr2、Fr3 三个部分。各部分均以 0.4g/kg(浸膏量)给药，给药体积 0.2ml/10g，进行急性毒性实验。2.2 急性毒性实验方法健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组 10 只。实验前禁食 12h，不禁水，灌胃给予相应的药物，一次给药;空白组给以相同体积的0.5%CMC-Na。给药 0.5h 后开始观察小鼠的中毒体征。连续 7d 观察小鼠死亡情况，随时取出死亡小鼠，记录死亡时
11、间。2.3 紫菀毒性部位小鼠 LD50 测定实验由预实验测得紫菀毒性部位的 LD0 和LD100 分别为 0.023g/kg 和 0.10g/kg，由此确定组间剂量比值为 0.75，即 Fr2部位 0.023，0.030，0.040，0.053，0.071，0.10g/kg 共 6 组(分别编为31，2，3，4，5，6 组)。2.4 紫菀毒性部位急性肝损伤实验健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组 10只。灌胃给予 LD0 剂量的紫菀毒性部位，给药体积 0.2ml/10g，空白组给予相同体积的 0.5%CMC-Na 溶液。给药后禁食 12h，不禁水，摘眼球取血，3500r/min 离心 10min
12、，取血清备用，解剖取肝脏，10%福尔马林溶液固定，HE 染色，进行组织病理学检查。按照试剂盒说明书操作测定血清中谷丙转换酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)的含量。实验数据采用 t 检验，P0.05 表示差异有统计学意义。健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组 10 只。灌胃给予 LD100剂量的紫菀毒性部位，给药体积 0.2ml/10g，空白组给予相同体积的 0.5%CMC-Na溶液。给药组待小鼠死亡后解剖取肝脏，10%福尔马林溶液固定，HE 染色，进行组织病理学检查。组织病理学检查判断标准：根据病变程度，记为“-” “+”“+”“+”。 “-”表示无明显病变;“+”表示肝小
13、叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞约占 25%，肝细胞点状坏死，肝小叶内或汇管区少量的炎细胞浸润及肝细胞增生;“+”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞约占 50%，细胞碎片状坏死，小叶内或汇管区中等量的炎细胞浸润;“+”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞数约占 75%或以上，桥接状坏死或大片坏死，肝小叶内或汇管区大量的炎细胞浸润或淋巴滤泡形成。3 结果3.1 紫菀毒性部位的筛选小鼠经灌胃给药后，A-2 组小鼠活动明显减少，精神萎靡，被毛蓬松潮湿，双目紧闭，尾巴、爪子呈现乌青色，不自主颤抖等现象，呼吸先快后慢，直至呼吸停止。给药后 36h 为死亡高峰期，死亡现象均发生在24
14、h 内。尸体解剖后，肉眼观察肝显黄色或白色斑点，表现为明显的肝中毒;其他组小鼠反应正常。急毒实验结果(表 1)显示，A-2 组小鼠给药后全部死亡，其他组未出现死亡，确定 A-2 有毒性。A-2 细分的 3 组灌胃给药后，Fr2 组小鼠体征表现同 A-2 组，急毒实验结果(表 2)显示，Fr2 给药小鼠全部死亡，其他组未出现死亡，故确定 Fr2 部位为紫菀的毒性部位。表 1A-1、A-2、A-3 给药小鼠急性毒性实验结果3.2 紫菀毒性部位小鼠 LD50 的测定实验紫菀毒性部位不同剂量灌胃给药后，小鼠死亡分布情况见表 3，经计算得紫菀毒性部位 LD50=0.052g/kg，95%可信限为 0.0
15、390.069g/kg。3.3 紫菀毒性部位对小鼠血清生化指标的影响 LD0 剂量给药后，小鼠血清生化指标检测结果(表 4)显示，与对照组相比，毒性部位 Fr2 组小鼠血清中ALT、AST 值升高，TBIL 没有显著性差异。表 2Fr1、Fr2、Fr3 给药小鼠急性毒性实验结果表 3 紫菀毒性部位不同剂量给药后小鼠死亡分布情况表 4LD0 剂量紫菀毒性部位对小鼠血清生化指标的影响3.4 紫菀毒性部位对小鼠肝脏组织形态影响 LD0 剂量单次给药，小鼠处死后解剖，肉眼观察肝脏呈鲜红色，质柔软，与空白组无明显差别;LD100 剂量给药后，约 3h 小鼠开始死亡，小鼠死亡后立刻取出尸体解剖，肉眼观察肝
16、脏表面有黄色或白色斑点，肝脏颜色较空白组浅。组织病理学结果(图 1)显示，与空白组(a)比较，LD0 剂量组(b)小鼠肝小叶结构尚清楚，部分肝索排列紊乱，肝细胞呈4轻度细胞水肿(+);可见肝细胞点状坏死(+)、肝小叶及汇管区见有炎细胞浸润(+)，纤维结缔组织增生不明显;LD100 剂量组(c)小鼠肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，肝细胞呈不同程度脂肪变性、细胞水肿(+);可见肝细胞坏死(+)、肝小叶及汇管区均见有炎细胞浸润(+)。纤维结缔组织增生不明显。a-空白组 b-LD0剂量组 c-LD100 剂量组图 1 紫菀毒性部位对小鼠肝脏组织形态的影响4 讨论紫菀始见于神农本草经 ，历代本草专著记载很多，但均未对其毒性有记载。 神农本草经将其列为中品，仅记载其“味苦温” ， 本草经集注 本草纲目等均有明确记载，曰“无毒” ，仅本草经疏中提到“不宜专用及多用” 。后世多接受典籍的记载，而认为紫菀无毒。文献报道4，紫菀中所含的皂苷类成分由于具有溶血作用，粗制剂不宜注射用。本课题组的研究表明紫菀的水
