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1、1紫萍提取物对过氧化氢诱导内皮细胞氧化损伤的保护作用研究【摘要】 目的研究紫萍提取物是否具有保护内皮细胞免受过氧化氢损伤的作用。方法采用 MTT 比色法筛选紫萍提取物作用于内皮细胞的安全剂量，建立H2O2 对内皮细胞的氧化损伤模型，并研究紫萍提取物的保护作用。最后采用检测试剂盒方法分析紫萍提取物作用后内皮细胞中超氧化物歧化酶（SOD） 、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性变化。结果紫萍提取物的浓度100 g/ml，作用时间为 24 h 时，无明显细胞毒性。以 1 mmol/L 的H2O2 作用于 ECV-304 细胞 1 h 造氧化损伤模型，10，25，50 g/m
2、l 的紫萍提取物具有预防氧化损伤作用，可使细胞的存活率由 21.98%分别上升至37.49%，51.71%和 64.74%，其机理可能是紫萍提取物能够剂量依赖性的增强SOD，CAT 和 GSH-Px 等酶的活性。但是紫萍提取物无治疗氧化损伤的作用。结论紫萍提取物可以有效保护内皮细胞免受氧化损伤。 【关键词】 紫萍 氧化损伤 过氧化氢 超氧化物歧化酶 过氧化氢酶 谷胱甘肽过氧化物酶Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of Spirodela polyrrhiza(L.) Schleid extract (SE) against the
3、 damage caused by hydrogen peroxide (H2O2) in human vascular endothelial cells (ECV-304). MethodsNormal ECV-304 cells were respectively incubated with SE 5400 g/m for 24h-96h, or H2O2 0.12510 mmol/L for 124 h, the survival rate of cells was determined by tetrazolium assay (MTT). To evaluate the prot
4、ective effect of SE on ECV-304 injury induced by H2O2, ECV-304 was divided into control, model, and SE treatment groups. In SE treatment group, ECV-304 was incubated with SE 550 g/ml for 24 h，before or after H2O2 1mmol/L (final concentration) was added to ECV-304 in the model group and the SE treatm
5、ent group for 1 h. The survival conditions of ECV-304 were expressed by the OD values assessed by MTT assay. Furthermore, the activities of SOD, CAT and GSH-Px in ECV-304 cells treated with 1050g/ml SE were determined by the corresponding assay kits. Results5，10，25，50 g/ml SE had no significant cyto
6、toxicity on ECV-304 at 24 h，but 100 g/ml , 200 g/ml ,and 400g/ml SE markedly decreased the survival rate at 24 h. The viability of ECV-304 was significantly inhibited by 1 mmol/L H2O2 at 1h. Pretreated with 10，25，50 g/ml SE, the survival rate and the activities of SOD, CAT and GSH-Px in cells were i
7、ncreased in a concentration-dependent manner. But SE had no protection on ECV-304 injury induced by H2O2. ConclusionSE has dual effects on the survival rate of ECV-304 in vitro, which is related to the concentration. Pretreatment with 1050 g/ml SE can protect ECV-304 against H2O2 2injury.Key words：S
8、pirodela polyrrhiza(L.) Schleid； Hydrogen peroxide； SOD； CAT； GSH-Px血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)是介于血液与血管壁之间的屏障，在创伤修复、血管生成、止血、血栓形成、出血性疾病、动脉粥样硬化、糖尿病等一系列生理和病理过程中起着重要作用。一旦内皮细胞受到损伤，则会导致血管屏障功能的损害，从而引发动脉粥样硬化、高血压病等多种心血管疾病的发生。导致 VEC 受损的原因很多，生物体内各种氧化-还原反应产生的羟基自由基（OH） 、超氧阴离子（O-2） 、过氧化氢（H2O2）等自由基(Reac
9、tive oxygen species, ROS )的累积是其中之一13 。血管内皮细胞功能性障碍的发生既可能是心脑血管疾病发病的始动环节，又可作为病情的观察指标和治疗学手段改进的突破口。因此，内皮细胞被认为是心、脑血管疾病基因治疗中最佳的靶细胞。选择血管内皮细胞作为研究的突破口既是可行的，亦符合未来发展方向，同时随着血管内皮细胞培养手段的成熟，内皮细胞为治疗心血管疾病药物的筛选和药理研究提供了新的实验材料，为在细胞水平进行心血管疾病相关药物的药理研究提供了可能。紫萍 Spirodela polyrrhiza(L.) Schleid 为浮萍科紫萍属植物的全草，辛、寒，入肺经，有祛风、发汗利尿、
10、消肿、行水、清热、解毒的功效，中医用于治疗荨麻疹、急性肾炎等4 。紫萍中除了含有蛋白质、-胡萝卜素、脂类化合物等物质外，还含有芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)、芹菜素-7-O-葡萄糖苷(apegenin-7-O-glucoside)和木犀草素-7-O-葡萄糖苷(leuteolin-7-O-glucoside) 等黄酮类化合物5 。本研究拟以体外培养的人脐静脉内皮细胞（ECV-304）为研究材料，选用 H2O2 诱导 ECV-304 氧化损伤的模型，从 ECV-304的存活率，细胞内超氧化物歧化酶（SOD） 、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px） 、过氧化氢酶（CAT）等酶
11、活性变化等方面入手，研究紫萍提取物（SE）对 ECV-304细胞的保护作用。旨在探讨该提取物是否具有减轻细胞氧化损伤的作用，从而为发现紫萍新的药理药效提供理论依据，同时也为探求开发紫萍资源的新途径奠定了基础。1 材料人脐静脉内皮细胞株 ECV-304，购自中国科学院上海细胞生物研究所。紫萍提取物（SE）：由本实验室自制，经过乙醇溶液回流提取、旋转浓缩、壳聚糖絮凝除杂、大孔吸附树脂纯化、真空干燥等步骤后得到该提取物，经过分析后发现其中主要含有黄酮类化合物，其含量大于 80。SE 溶解于 DMSO 中，配成母液，-20冰箱保存。实验前用培养液稀释到所需要的浓度（DMSO 的终浓度0.1%） ，0.
12、22 m 的微孔过滤器过滤。RPMI-1640 培养基、胎牛血清购自 GIBCO 公司；SOD，GSH-Px，CAT 测定试剂盒均购自南京建成生物研究所；MTT 购自 Sigma 公司。32 方法2.1 ECV-304 的培养 ECV-304 培养于含 10%的胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中，置于 37的细胞培养箱中（5% CO2） ，待细胞铺满培养瓶 80%90%左右时，用 0.25%胰酶0.02%EDTA 的消化液进行传代培养。2.2 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法 MTT 溶解于 PBS 中，配成 5 mg/ml 的溶液，0.22 m 的微孔滤膜过滤后避光保存，于一周内用完。在
13、加入 MTT 前，吸弃培养板中各孔的培养液，PBS 洗 12 次，然后加入新鲜培养液和 10%的 MTT，于细胞培养箱中培养 4 h 后，吸弃培养液，加入 200 l 的 DMSO，在振荡器上振荡 10 min，待充分溶解后，于 Model 550 多孔酶标仪 570 nm 处检测吸光值。2.3 SE 对 ECV-304 细胞的影响（45）104 个/ml 密度的 ECV-304 细胞接种于 96 孔培养板中，每孔 100 l。培养 24 h 后，吸弃培养液，加入含药培养液，SE 的终浓度分别为 5，10，25，50，100，200，400 g/ml，另设对照组，常规培养。分别培养 24，48
14、，72，96 h 后， 用 MTT 比色法检测各孔吸光值。2.4 H2O2 对内皮细胞损伤实验（45）104 个/ml 密度的 ECV-304 细胞接种于 24 孔培养板中，每孔 1 000 l。培养 24 h 后，吸弃培养液，加入新鲜培养液和 H2O2，其终浓度分别为 0.125，0.25，0.5，1，2 mmol/L。处理1，2，4 h 和 24 h 后，用 MTT 比色法检测各孔吸光值。2.5 SE 对 H2O2 损伤内皮细胞的保护作用（45）104 个/ml 密度的 ECV-304 细胞接种于 24 孔培养板中，每孔 1 000 l。培养 24 h 后，吸弃培养液，后续实验分为两个方向
15、进行。 2.5.1 SE 的预防作用实验分为对照组、损伤组和预防组。对照组细胞按常规方法培养，损伤组细胞用不含药培养液培养，其余的处理方法与对照组细胞相同。处理组细胞分别用终浓度为 5，10，25，50 g/ml 的 SE 预处理 24 h 后，吸弃培养液，PBS 冲洗 12 次，加入 H2O2 终浓度为 1 mmol/L 的培养液，处理 1 h 后，MTT 检测吸光值。2.5.2 SE 的治疗作用实验分为对照组、损伤组和治疗组。对照组细胞按常规方法培养。损伤组和治疗组的细胞分别用 H2O2 终浓度为 1 mmol/L 的培养液，预先处理 1 h，吸弃培养液，PBS 冲洗 12 次。损伤组用不
16、含药培养液培养，治疗组分别加入含药培养液，SE 终浓度为 5，10，25，50 g/ml，处理 24 h，用MTT 法检测各孔吸光值。2.6 SOD，GSH-Px，CAT 测定实验设对照组、损伤组和处理组。将等量 ECV-304 细胞接种于 50 ml 细胞培养瓶中，培养 48 h 后，吸弃培养液，对照组和损伤组加入新鲜的不含药培养液，常规培养。处理组加入含药培养液，STF 终浓度分别为 10，25，50 g/ml。继续培养 24 h 后，损伤组用 1 mmol/L 的 H2O2 处理 1 h。吸弃各实验组的培养液，PBS 冲洗 12 次，消化液消化，用等量的 PBS收集细胞。超声破碎仪破碎后，按照各个试剂盒的操作说明进行操作。42.7 数据处理以 DPS 统计软件对实验结果进行分析，数据均以s 表示。3 结果3.1 SE 对 ECV-304 细胞的影响设对照组与实验组。对照组仅用培养液培养，试验组加入不用浓度的 SE（5，10，25，50，100
