CD34造血干细胞计数.pdf

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1、联科生物技术有限公司 CD34 细胞计数- 1 - / 技术支持： 电子邮件： 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 C D 3 4 + 细胞计数 外周血现已被广泛地被用作骨髓移植、 癌症患者接受大剂量化疗或放疗后骨髓重建造所 需血干细胞（Hemotopoietic Progenitor Cells HPC）的来源。外周血源性干细胞现主要被运用 自体移植，其应用面也逐步拓展至异基因骨髓移植中。使用外周血替代骨髓作为造血干细胞 的来源有着以下优点：1，易采集；2，对供者无需全身麻醉；3，减少了采集后并发症的发 生；4，受者造血系统重建快；

2、5，费用低；6，住院时间缩短或可部分或全部在门诊处完成 操作。 相对于骨髓，外周血中的造血干细胞一般只出现一次高峰，其数量取决于供者血体积和 /或单个核细胞的数量。由于外周血中造血干细胞含量很低，固常规中运用多极分离技术来 收集这些细胞。在早期临床研究中，收集的干细胞作为移植物数量是否足够很不清楚。因为 要检测这些细胞数量需要使用集落形成实验， 但此法明显不适用于临床， 因其大致需要 12- 15 天时间出结果， 故无法满足临床中当天出报告决定移植是否继续的要求。 此问题自发现CD34 抗体可鉴别造血干细胞，并成功地被运用流式细胞仪定量检测造血干细胞后被圆满解决了。 CD34+造血干细胞植活最

3、低数量要求是 2- 5 x 106/公斤体重。然而正常人外周血中干细 胞数量只占所有有核细胞的 0.1%。很明显这些数量的干细胞是不足够运用于移植的，除非 使用恰当技术增加外周血干细胞的含量供采集。此技术可通过给予供者集落刺激因子（通常 是粒或粒- 单集落刺激因子），同时可联合骨髓抑制剂（如环磷酰胺）的方法动员造血干细 胞进入循环外周血中。联合使用化疗药物与集落刺激因子造成短暂的循环血中髓系细胞抑 制，随后使骨髓代偿性地释放髓祖细胞、造血干细胞至外周血，从而达到动员干细胞的目的。 联合使用细胞毒药物与集落刺激因子可延长抑制时间， 相对于单独使用集落刺激因子可增加 动员至外周血中的干细胞。对于正

4、常人供者不可使用化疗药物来抑制外周血，常使用 G 或 GM- CSF、血小板刺激因子来动员。关于如何使用动员药物请参见其他相关文献。 早期外周干细胞计数 在尚未应用流式细胞仪定量检测 CD34+细胞时，外周血干细胞计数常运用单位- 粒/巨噬 细胞集落形成实验间接求得。 这项检测技术通过直接计数干细胞形所的集落来反映干细胞的 数量，故被认为是检测是否存干细胞的金标准。但也有学者置疑此检测是否与移植成活率有 很好的相关性。因为在这项技术中，各研究单位缺乏统一的检测标准；刺激因子不同的处理 方法和不同的配伍使用；集落形成后不同的计数方法都造成了统计数据具有很大的变异性。 常规体外集落形成实验主要检测

5、髓系祖细胞并要求大约 14 天取得结果，使得该项检测无法 来确定临床何时采集干细胞；所以以前只根据循环血中的最大集落数（CFU 而非 CFU- GM） 来确定采集多少细胞。 使用 CD34 识别造血干细胞 自从发现、纯化、标记抗 CD34 单克隆抗体开始，使流式细胞定量检测在外周血或骨髓 中的 CD34 阳性造血干细胞成为了可能。CD34 抗原存在于各种祖细胞上，其中包括多能干 细胞和间质干细胞。在某些组织的上皮细胞上也有表达。 CD34 抗原的分子量为 105- 120KD， 具有一个高度糖基化的类粘蛋白的结构。内皮细胞的 CD34 抗原与 L 选择素结合，然而造血 干细胞上的 CD34 抗

6、原的配体至今还未发现，有学者认为此抗原在细胞粘附中起作用。通过 联科生物技术有限公司 CD34 细胞计数- 2 - / 技术支持： 电子邮件： 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 与不同特异性的 Vibrio cholera 神经氨酸苷酶和 Pasturella hemolytica 起源的糖蛋白酶作用可 区分出此抗原的不同位点。这些位点根据其与不同的抗体结合情况可分为 I，II 和 III 类， 最近有报道 I 和 II 类抗原应属同一家族，因为它们具有相似的抗原结构和功能属性。这些研 究都是基于交叉封闭实验的，故不可作为评价抗体结

7、合效率或抗原空间结构之用。 II 类抗原 位点具有由非糖基化氨基酸构成的线性申展结构， 四周由在远 N 未端组成 CD34 的 I 抗原的 类糖酶结构环绕。尽管 I 类与 II 类抗原几乎合二为一，但它们化学和物理性质是不同的 Siena 领导的工作组是第一个报道使用流式细胞仪定量检测 CD34+造血干细胞的含量， 来决定动员干细胞及采集最佳时间，并研究 CD33 在干细胞上的表达与移植效果的相关性。 CD34 阳性细胞运用 SSC 与 CD34 双参数流式点图来检测。在此项研究中发现所有的 CD34 阳性细胞均与形成 CFU- CM 集落相关；并证实 CD34+细胞计数是决定干细胞采集时间有

8、效 方法。此外，Fritsch 及其工作组发现 CD34 阳性细胞比例与外周血单个核细胞数量和 CFU- GM 和 CFUGEMM 检测的集落形成能力有相关性。这些结果被其他学者相继证实，并 使流细胞仪成为定量检测 CD34+细胞成为监测动员干细胞和计数移植中造血干细胞数量的 有效、精确的工具。 尽管以前工作已证实造血干细胞表达 CD34 抗原， 但鉴别多能干细胞的复杂工作才刚刚 开始。Siena 及其工作组发现 CD34+CD33+双阳性细胞数量与早期移植成功有相关性。同时 Tertappen 注意到骨髓中提取的 CD34+CD38- 阴性的细胞在 IL- 3，IL- 6 和 GM- CSF

9、 刺激下能 够形成最原始的集落；随着 CD38 抗原的增加，CD34 阳性细胞形成这种原始集落的能力下 降。在 CD34+细胞中，CD34+CD38- 表型的细胞占 1.0%左右。随后又发现了其他细胞表面 抗原在识别多能干细胞中起着重要作用。对于绝大多数临床应用来说，计数 CD34 阳性细胞 已足够为移植提供可靠、持久的参数。然而计数更为原始的多能干细胞能够提供其他重要的 信息，所以有必要发展下面将叙述的技术来达成此目标。此外可发现、鉴别更新的一些干细 胞抗体来提供更为直接的检测方案，如：ACC- 133 和 F84.1。 在达到一个稳定、长期的移植成功的疗效中， CD34+阳性细胞最少需求量

10、方面还存在争 议。Bender 发现大约 2x106 CD34+细胞/公斤体重的剂量能够保证可靠的移植成功率。在许 多病例中，这个剂量很容易从动员的病人或正常人中收集到。Bensinger 及其工作组发现 CD34+阳性细胞与血小板、粒细胞重建时间有很强的相关性，并建议 CD34+细胞最佳剂量 是 5x106/kg。一个对 692 例自体移植病例研究也得出了相似的结论。 在移植前处理治疗中，病人的耐受性及用药的强度等因素会造成以上情况，Tricot 等观 察 225 例接受 PBPC 移植的病例和经 PBPC 输入治疗了难治性骨髓瘤患者， 发现以上因素使 自体移植中 CD34+细胞的最佳剂量各

11、不相同。此研究表明，对于移植前接受化疗少于 24 个 月的病人，快速植活剂量应2.0 X 106 CD34+细胞/kg；对于长期接受全身化疗的病人（大于 24 人月）最低剂量则为5.0 X 106 CD34+细胞/kg。此处接受短期化疗的病人更容易、快速 地取得 CD34+细胞。总而言之，这些研究表达 2- 5 X 106 CD34+细胞/kg 的剂量对于大多数 情况下是足够的，但也有研究表明更高剂量的 CD34+细胞移植能够帮助病例更容易克服组 织相容性问题。以下将要讨论有关 CD34+细胞的检测技术，有些推荐剂量之间的差异正是 由于检测方案不同所引起的。 CD34 检测方案变异系数及其标准

12、化 流式细胞 CD34 干细胞计数为成为应用广泛的实时检测 PBPC 是否足够移植的有效方 法。对动员后供者循环外周血中 CD34+细胞绝对计数能够预测采集物中干细胞的数量，并 越来越多地用来决定何时可开始采集干细胞。 根据 CD34 阳性细胞在样本中的含量将决定是 联科生物技术有限公司 CD34 细胞计数- 3 - / 技术支持： 电子邮件： 免费电话：8008282330 8008571184 传真电话：86 512 68668874 否继续给予生长因子刺激、采集是否继续。每次干细胞采集需要志愿者在护士的照顾下进行 3- 4 个小时的干细胞分离过程，采集的细胞在体外需要进行特殊的处理或进行

13、低温保存。从 治疗时间及消耗资源的意义上来说，以上动员、采集过程的费用是非常昂贵的，对于有经济 困难的患者来说此部分的费用占了移植总费用的重要比例。在早期的研究中，干细胞动员方 案还未被应用，运用全部有核细胞计数作为移植物采集指标；有时会为单个病人采集相当于 现在 20 倍数量的细胞用于移植，这不仅会增加标本保存成本，还会带来病人体液过量的临 床问题。 CD34+细胞计数作为移植物采集量化标准解决以上所及的许多问题，但它也带来许 多新的疑问。 米兰方案 第一个广泛应用的干细胞计数方案是由 Istituto Nazionale Tumori in Milan 的 Siena 等人 创立的米兰方案

14、（Milan Protocol）。在此方案中，需准备三管 50 ul 的血样或 leukapheresis 样本（如白细胞计数小于 150ul，如受者样本，则样本和抗体均需加倍）；其中一管留出不 作染色，一管加入 15ul 的抗 CD34 和 CD33 抗体，第三管则加入 15ul 的抗 CD2/CD19 抗体 （计数 T、B细胞）。细胞在 4下避光孵育 25 分钟，之后加入红细胞裂解液。孵育 15 分 钟后加入不含钙、镁离子的 PBS 洗液 300g 离心 7 分钟洗涤，如果红细胞裂解不彻底则可重 复裂解过程。弃上清后细胞可在 4保存并于一小时内上机检测。在光散射参数中分析所有 细胞，建立门

15、圈定所有白细胞（排除碎片），并设立一门去除有自发荧光的细胞。在调节完 补偿后，分析 10000 个细胞，CD34+细胞可通过低 SSC 信号和 CD34 阳性表达加以区分。 CD34 弱阳性细胞一般不分析。 目前有很多米兰方案的改进版，分别从：运用不同的 CD34 抗体、不同的溶血技术、加入其 他抗体来提高鉴别力、变换荧光标记、使用 CD45 抗体或其他核酸染料来更方便地鉴别白细 胞等方面进行改进。运用这些技术后，报道的移植所需足够的并且能快速完成的 CD34+细 胞数量有着巨大差异。 经过仔细研究发现这些差异是由于在 CD34 细胞计数过程中运用了不 同的标本处理、染色和分析方法造成的。因为在未动员的正常外周血中，CD34 阳性细胞通 常小于全部有核细胞的 1%，在经 G- CSF 动员后志愿者外周血中会大于 5%（有时在用血小 板形成因子动员时可大于 20%），对它们的精确计数对许多流式实验室是个重要的挑战。 特别在计数小于 1%时，又要做出检测来决何时进行采集时，精确计数显得格外重要。 Multi- Center 方法研究报告 Multi- Center 研究所在北美、欧洲、澳大利亚所做的一系列研究使得在精确计数中存在 联科生物技术有限公司 CD34 细胞计数- 4 - / 技术支持： 电子邮件：servicegot