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1、第六章 兽药残留检测技术,第八节 激素类药物残留的危害分析与检测方法,一、概述,兽用激素包括皮质激素、同化激素。天然皮质激素主要有可的松及氢化可的松。这类皮质激素有较强的糖代谢及抗炎等作用,而对水、盐代谢的作用较弱,所以称其为糖皮质激素。临床上应用广泛。通常所说的皮质激素即指这类激素。近年来,为了提高疗效,降低副作用,而合成了一系列的糖皮质激素衍生物。如泼尼松(强的松)与氢化泼尼松(强的松龙),糖原异生作用更强,对水盐平衡的影响更弱。较小剂量常用于补充肾上腺皮质功能缺乏,较大剂量则能抑制免疫过程中的多个环节，缓解炎症。,1、糖皮质激素,糖皮质激素的主要作用是能降低机体对内外环境各种刺激的反应性
2、,具体表现在抗炎、免疫抑制、抗毒素和抗休克等方面。还可使血糖升高,蛋白质分解加强,使血淋巴细胞、嗜酸性细胞减少,红细胞、嗜中性粒细胞、血小板增高等。糖皮质激素主要用于以下疾病:各种炎症、严重感染及传染病、过敏性疾病、风湿病、休克、代谢疾病以及引产。皮质激素会引起水分在体内滞留,增加肉的重量,因而在畜牧业中有可能当作增重剂而被滥用。滥用这类药物后,肉品感官上多汁、肉瘦。因此饲养场中用皮质激素作催长剂，属于违禁使用。,泼尼松,别名强的松,不溶于水,微溶于乙醇。应避光、密封保存。具有抗炎及抗过敏作用,还能促进蛋白质分解转变为糖,减少葡萄糖的利用,因而使血糖及肝糖原增加,尿中可出现糖尿,同时增加胃液分
3、泌,促进食欲。其水、钠潴留及促进钾排泄作用比可的松小,抗炎及抗过敏作用较强,副作用较小,故比较常用。主要用于各种急性严重细菌感染、严重的过敏性疾病、风湿、类风湿、肾病综合征、支气管哮喘、各种肾上腺皮质功能不足症、湿疹等。,地塞米松,别名氟美松,不溶于水,溶于无水乙醇。应遮光保存。抗炎及控制皮肤过敏的作用比泼尼松龙更显著,而对水、钠潴留和促进钾排泄作用较弱。目前地塞米松的应用愈来愈广泛,有取代泼尼松等其他合成皮质激素的趋势。肌注后吸收快,狗和鼠分别于0.5h和6h达血药峰浓度。大部分在肝内被代谢成羟基地塞米松及其葡萄糖苷结合物而灭活。,氟轻松,氟轻松为白色结晶性粉末,无臭,不溶于水,溶于乙醇。应
4、遮光、密封保存。氟轻松为外用皮质激素中疗效最显著而副作用较小的一种,涂敷于局部对皮肤、黏膜的炎症(搔痒及皮肤过敏反应等有效。不但疗效高,而且显效快,使用很低浓度即有明显作用,止痒作用尤其突出。本品主要用于各种皮肤病,如湿疹、过敏性皮炎、皮肤瘙痒等。对局部化脓创面,需同时配合新霉素等抗生素。,倍他米松,倍他米松为白色结晶性粉末,无臭,味苦,几乎不溶于水,溶于乙醇。本品含有多种盐类,如磷酸钠盐、二丙酸盐、醋酸盐等。均应遮光保存。内服吸收良好,生物利用度约为72%,血浆蛋白结合率64%,半衰期5.6h,4.8%的药量自尿液排出。牛肌注80g/kg,停药二日,肝脏中母药残留量为5.47.8g/kg;
5、停药八日,肝脏中母药残留量为10.9g/kg,肾脏、肌肉和脂肪中母药残留量分别为2.3g/kg、3.9g/kg和4.4g/kg。,2、同化激素,例如：雄激素能明显地促进蛋白质合成(同化作用),能使肌肉发达,体重增加;同时氨基酸分解减少(异化作用),使尿素生成减少降低氮质血症。但使用雄激素常可出现男性化现象,因而限制了它的应用。近年来人工合成的一些衍生物,其雄激素作用大为减弱,而同化作用则保留或增强,这些衍生物称同化激素。同化激素主要用于蛋白质同化或吸收不足、降低亢进和损失过多等情况。畜牧业中使用同化激素(非治疗用途，提高胴体品质、增重和提高饲料转化率),可以很快产生显著和直接的经济效益,因此对
6、生产者有很大的吸引力。,同化激素类药物,去氢睾酮、去氢甲睾酮、醋酸氯地孕酮、氯睾酮、乙烯雌醇、醋酸甲羟孕酮、醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮、诺甲醋孕酮、去甲睾酮、司坦唑醇、醋酸群勃龙等,醋酸甲羟孕酮,作用与黄体酮相似,孕激素活性强,无雌激素和雄激素活性,有抗雌激素作用。内服、注射均有效。内服在胃肠道吸收,在肝内降解。肌内注射后23天血药浓度达到峰值。血药峰值越高,药物清除越快。肌注150mg后69个月血中才检不出药物。小牛肌注复方制剂(24mg醋酸甲羟孕酮、100mg苯甲酸雌二醇、200mg癸酸去甲睾酮)后停药2天,血浆中醋酸甲羟孕酮浓度为1g/kg,14天时降至30pg/kg。尿液在数天内都能检
7、出,14天时醋酸甲羟孕酮浓度为37pg/kg。肾组织残留相对较高,故作为残留检测的靶组织。,醋酸美仑孕酮,别名醋酸甲烯雌醇,为合成的避孕药。内服时孕激素作用约为黄体酮的75倍,无雌激素和雄激素活性,具有显著排卵抑制作用。小母牛用药后,母药和代谢物主要由粪便排出。停药6h,肝、脂肪、肾和肌肉组织中的残留量分别为915g/kg、78g/kg、1.21.8g/kg和0.51g/kg。脂肪、肝、肾和肌肉中母药残留量分别占总残留的80%、37%、30%和45%。美国FDA规定休药期48h,但欧盟禁止使用。,去甲睾酮,牛注射去甲睾酮后,脂肪中残留能被检出,并持续73天;尿中残留低于1g/kg。内服后脂肪中
8、残留未被检出,但尿中残留可检出。,醋酸甲地孕酮,本品为孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用,但比左炔诺孕酮和炔诺酮为弱。不具有雌激素和雄激素样活性,但有明显抗雌激素作用。与雌激素合用,抑制排卵。动物致畸试验表明对家兔具有死胎率增加和致畸作用。口服后生物半衰期明显比左炔诺孕酮为短,大部分代谢产物以葡萄糖醛酸酯形式排出。,3、危害,对人体危害较为严重的主要有甾类同化激素(包括雌酮、雌二醇、睾酮、皮质酮等物质)及2-受体激动剂(苯乙胺类)。这些存在于环境介质中的激素量虽然很小,但大多具有生物富集作用,容易通过食物链在人体中富集,对人类及其他生物产生极其严重的危害。主要产生各种慢性、蓄积性毒性
9、,如致癌、致畸、致突变等三致性毒性以及免疫毒性、发育毒性和生态毒性等。2-受体激动剂类药物可产生急性毒性作用。危害多具有隐蔽性,易造成实质性危害而难以逆转。,糖皮质激素的危害,对人体的危害主要表现为抑制肾上腺皮质功能,使肾上腺皮质萎缩。另外,过多摄入,可使人产生多毛症、满月脸以及免疫力下降等毒副作用。对敏感型的个体可造成血管扩张,血压降低而引起休克,甚至死亡。,同化激素的危害,目前,同化激素对环境的污染已引起了社会各界的普遍关注。长期摄入同化激素，即使含量甚微，也会导致机体代谢紊乱、发育异常,且多数激素类物质具有潜在的致癌作用。欧盟(原欧洲经济共同体)从1988年起,禁止所有同化激素用于动物的
10、促生长目的,并制定了严格的监测措施。我国从20世纪90年代起,也陆续开始对用于促生长目的的同化激素禁止使用,并已开展了相关的监测工作。但是,在利益驱动下,在世界范围内,同化激素仍在被大量滥用。就残留的危害和引起的争议而言,同化激素与抗生素并列为最重要的兽药残留。,雄性激素及其同化激素的危害,进人人体和动物体后,对其生殖功能产生严重的影响,甚至可能造成某些物种的绝种。通过食物链进行富集,在人体首先引起内分泌失调,危害生殖系统,易出现生殖器病变。对男性的危害：表现为睾丸萎缩、胸部扩大、早秃、肝肾功能障碍或肝脏肿瘤。对女性的危害：可引起女性的不孕、早产、流产、月经不调或女性男性化(肌肉增生、毛发增多
11、)等现象。目前,在局部地区已开始出现人类生存危机现象,如发达国家约有20%的家庭没有子女,而睾丸癌的患者明显增加。,对其他动物的危害,激素污染对人类以外的其他动物影响更为显著,如鱼、鸟和哺乳动物的大量死亡,雌雄异变,生育和发育紊乱,免疫力下降等现象,可能均与此有关。1980年左右,美国一造纸厂废水排出口下游的雌性鱼雄性化,且雄性化后的鱼与原先正常雌性鱼进行交尾,原来正常雄性鱼出现超雄化,并表现为攻击性交尾行动。在日本,发现有雌海螺长有雄海螺的生殖器。,雌性激素的危害,雌性激素造成的环境污染,同样可能造成某些物种的绝种。通过食物链产生的富集作用,可引起人体的内分泌失调,对男性的危害：使男性精子数
12、量下降或出现女性化、性早熟、抑制骨骼发育等。对女性的危害：可引起女性 性早熟、生殖器官畸形和癌变,这一效应在其女性后代中表现更显著。对人类后代的危害：这些激素透过胎盘,可引起用药者子宫内膜及女性后代的阴道宫颈癌变和男性后代的精子发育不良、生殖器畸形。,对其他动物的危害,雌性激素的污染对人类之外的其他动物,同样有着严重的影响。美国出现的雄性美洲狮雌性化、加拿大的海豚在生殖周期出现卵巢异常、南极企鹅产下无精卵以及其他一些连体、畸形动物的较高比例出现,可能均与环境激素污染有关。,二、样品处理,（一）皮质激素的样品处理（二）同化激素的样品处理,（一）皮质激素,1、皮质激素样品预处理液体样品(奶、血液、
13、尿液)提取前需要脱脂肪,通常在4 、7000g离心,除去浮在上层的脂肪。组织样品(肌肉、肝、肾)先要用切碎机或匀浆器进行组织破碎。水或醋酸盐缓冲液常用于样品的稀释。肝脏或尿样中的皮质激素结合物较多,因此先用葡糖苷酸酶/硫酸酯酶水解。由于酶解反应较慢,为保证水解完全,可在较高的温度下来加速水解或延长孵育时间。用超临界萃取法提取时,先要将组织样品匀浆,再进行冷冻干燥。,2、提取皮质激素,在一定的pH值条件下,一般用有机溶剂对样品提取和除蛋白。例如,氯仿提取牛奶中的氢化可的松;二氯甲烷-正己烷(4+1)提取牛奶中游离的氢化可的松和21-醋酸酯;乙酸乙酯提取动物组织中的氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的
14、松龙、倍他米松,牛奶中的甲基强的松龙，牛奶中的氢化波尼松和地塞米松;含0.1mol/L氢氧化钠的乙酸乙酯提取牛组织中的地塞米松;,有机溶剂法提取,甲醇提取牛肉组织中的5种皮质激素;乙腈提取牛肝脏中的5种人工合成的皮质激素和牛组织中的地塞米松;乙醚提取牛粪中9种合成的皮质激素;二氯甲烷提取动物脂肪中的氟强的松龙;丙酮提取动物肝脏(肾脏和肌肉中的氟强的松龙。此外,牛奶和尿样可以直接用水或醋酸盐缓冲液稀释并提取。,3、净化,粗提取液中含大量的内源性干扰物质,为了消除或降低干扰并浓缩分析物,样液需要净化处理。净化方法包括液-液萃取、固相萃取、免疫亲和色谱及柱切换技术等。液-液萃取可以简单的一次溶剂萃取
15、,也可以多次溶剂萃取。萃取次数的多少,很大程度上取决于色谱的分离效率和选择性。色谱的分离度和选择性愈高,样品的提取和净化步骤可以简略一些,还可以提高分析效率。,液-液萃取法,液-液萃取可以除去生物样品中大部分杂质和蛋白质。例如,氢化波尼松、氟强的松龙、氟羟强的松龙和倍他米松的乙酸乙酯提取液,依次用稀酸溶液和稀碱溶液洗涤,可以除去碱性和酸性的水溶性杂质。地塞米松的乙酸乙酯提取液,可以用氢氧化钠溶液洗涤,以除去酚类雌激素。甲基强的松龙的初提液蒸发至干后,用乙腈溶解,加入正已烷提取,正已烷提取液再用饱和的硫酸钠水溶液提取,最后用二氯甲烷提取。,氟强的松龙提取液蒸发至干后,依次用乙腈和正己烷,正己烷和
16、水进行液-液萃取,最后用二氯甲烷提取。通过液-液萃取对分析物的提纯,可以降低仪器检测的背景干扰,大大提高分析方法的检测灵敏度。皮质激素的初提液还可通过三相液-液分配净化：当组织样用乙腈水溶液初提后,上清液加入正己烷和二氯甲烷,进行乙腈、正己烷和二氯甲烷的三相液-液萃取,非极性组分被分配到正己烷相中,极性和离子化组分被分配到底层水相中,皮质激素和其他中等极性组分则分配到中间乙腈相中。,固相萃取法,采用有机溶剂萃取法容易出现乳化现象,因而常常导致提取回收率偏低或不稳定。固相萃取法克服了这一缺点,且具有操作简便、快速的优点。常用的固相萃取柱吸附剂有C18、C8和弗洛里硅藻土(Florisil)等。例如,C18固相萃取柱用于猪血浆中天然的和合成的皮质激素净化,血浆或血清样品中氢化可的松净化。Florisil柱用于牛奶中氢化可的松净化和牛组织中氟强的松龙净化。,免疫亲和柱色谱法,免疫亲和柱具有高的专一性,近年来发展迅速,已应用于皮质激素的生物样品制备。例如,用两种抗体结合的免疫亲和柱,可以分离纯化肝、牛奶、尿样和粪样中9种皮质激素。免疫亲和色谱与GC-负离子化学电离质谱联用,已用于马组织中双氟美松的确证分析。,
