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1、人源化抗体研究进展摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。人源化抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、器官移植和病毒感染等方面已经显示出独特的优势和良好的应用前景。本文综述了人源化抗体的构建及其表达系统，在临床上的应用，存在的问题及展望。关键词：嵌合抗体，人源化抗体，构建，临床应用从20世纪70年代英国学者Milstein和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来1，单克隆抗体
2、在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而，单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢，主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体(human antigen mouse antibody，HAMA)；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造，减少异源抗体的免疫原性
3、，成为单克隆抗体研究的重点2。随着对抗体基因的研究和DNA分子重组技术的应用，通过基因改造获得特异性抗体成为可能。1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体基因工程抗体技术的发展。至此，抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。1 人源化抗体的构建人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。
4、1.1 嵌合抗体抗体分子与大抗原结合特异性由L链和H链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应，产生抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）。将小鼠单克隆抗体C区用人抗体C区代替而拼接成嵌合抗体(chimeric antibody)，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。嵌合抗体(chimeric antibody) 属第一代人源化抗体，有60%70%的人源区域，是目前研究较多也较为成熟的基因工程抗体，人鼠嵌合抗
5、体基因工程改造策略主要包括：（1）从鼠杂交瘤中克隆V区基因。（2）选择合适的人C区基因。（3）构建载体并在一定表达系统中表达根据嵌合抗体H链和L链基因是否克隆、表达与同一载体与否，可将基因工程嵌合抗体的表达分为共转染表达模式(co-transfection model)和单载体转染表达模式(single vector transfection model)。根据所需达到的功能，人重链的恒定区可为IgA、IgD、IgE、IgG 或IgM中的一种。通常，人源抗体包括嵌合抗体常采用IgG，因其对不同的亚基都合适。1986 年，Jones3等用寡核苷酸构建出小鼠抗半抗原4-羟基-3-硝基苯乙酰基己酸(
6、NP)的免疫球蛋白VH 基因，其中编码VH 互补决定区(CDR)的序列来自小鼠的单抗，编码构架区(FR) 的序列来自与鼠抗NP 单抗的FR 同源程度较高的人骨髓瘤蛋白，通过人抗NP 重链可变区基因(hVHNP) 与含有人重链恒定区序列的表达载体连接，并转染到只分泌抗NP轻链的小鼠杂交瘤细胞J558L中， 结果获得可特异结合NP的人源化嵌合抗体。康向东等4从分泌抗人甲状腺球蛋白的杂交瘤细胞株hTg-60中提取总RNA，逆转录-酶链聚合反应(RT-PCR)扩增出鼠源性单克隆抗体hTg -60的VH及VL基因，经基因测序分析，设计出人源化抗体的基因引物，获得抗Tg单克隆抗体人源化VH及VL基因并将其
7、克隆入真核表达载体，转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，表达人源化嵌合抗hTg抗体。成功获得了6株能稳定分泌抗hTg人源化嵌合抗体的细胞株。1.2 CDR 移植抗体尽管嵌合抗体Fc段换成了人源化，但V区保留的鼠源性保守序列仍能诱发HAMA，因此嵌合抗体不能彻底地消除鼠免疫原性，还需进一步对鼠源抗体的V区进行改造。抗体V区由CDR和骨架区（FR）组成。CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定了抗体的特异性，而骨架区序列及其立体结构较为保守，是嵌合抗体诱发HAMA的主要原因，因此将鼠单克隆抗体CDR移植到人单克隆抗体的V区框架上，使人单克隆抗体获得鼠单克隆抗体结合特异性，并减少异源性。这样获得的改型
8、抗体也称CDR移植抗体(CDR grafting antibody)。然而，抗原虽然主要和抗体的CDR接触，但FR区也常参与作用，影响CDR的空间构型。因此换成人源FR区后，这种鼠源CDR和人源FR相嵌的V区，可能改变了单抗原有的CDR构型，往往明显降低抗原-抗体反应的亲和力， 甚至丧失与抗原结合的能力5。因此解决骨架区对CDR的影响，对CDR序列和框架结构进行分析和加工是十分重要的。V区CDR移植的设计原则是：（1）以Kabat的方法为基础选择顶端环状结构序列和紧邻CDR两侧的骨架序列：（2）对骨架区中影响抗原结合部位的氨基酸残基改为亲本鼠单克隆抗体的残基；（3）对抗体V区氨基酸序列数据库分
9、析，选择与亲本鼠单克隆抗体同源性高的序列；（4）保留V区N末端氨基酸序列，尤其是L链V区N末端序列。将人改型V区基因与人Ig C区基因连接，构成完整的人免疫球蛋白基因即可进行表达。Couto 等6首先利用计算机模建和实验探索找到一个最简模板。以此模板对抗乳腺表皮抗原BA46 的抗体Mc3 成功地进行了人源化。由于人源化抗体( 嵌合或CDR 移植抗体) 内还含有10%30%的鼠源蛋白，因而在临床应用时，或多或少地存在一些免疫排斥反应，没有达到治疗性抗体发展的最终目标抗体完全人源化。1.3 完全人源化抗体全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程
10、改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体完全人源化的目的。目前生产完全人源化抗体的方法主要包括抗体库技术和转基因技术，这2 种制备技术竞争至今，孰优孰劣尚未可知7。1.3.1 抗体库技术噬菌体抗体库技术的出现开创了一条简便快捷的基因工程抗体生产路线，为人源化抗体的制备提供了新途径。噬菌体抗体库( phage antibody library) 技术是20 世纪90 年代初期抗体工程领域的重大研究进展，它结合了噬菌体展示与抗体组合文库技术，把外源的DNA 插入噬菌体编码的外壳蛋白p或p的基因中，使外源DNA 片段对应的表达产物融合在噬菌体外壳蛋白中形成融合蛋白。此方法包括噬菌体库的
11、产生、结合抗原的展示抗体的筛选、展示有高亲和力抗体的噬菌体扩增、有高亲和力的抗体的分离和定性的具体步骤8。其基本方法是从人外周血淋巴细胞或脾细胞中提取RNA 或基因组DNA，设计核苷酸引物，用PCR方法克隆人全套抗体重链及轻链可变区基因组装到噬菌体表达载体内，与噬菌体外壳蛋白基因融合，感染大肠杆菌并使抗体片段表达于噬菌体。然后利用抗原抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆性扩增，获得可溶性抗体片段(如Fab、scFV及dsFv等) ，即噬菌体抗体9。1989 年美国Scripps 研究所Lerner 实验室首次应用噬菌体表面展示技术构建了噬菌体抗体库10。该技术在制备基因工程抗体方面发
12、展迅速， 国内外已有人源或鼠源抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbB2、gp120等噬菌体抗体的报道。Vitaliti 等11利用噬菌体抗体库技术制备了抗血管内皮生长因子(VEGF) 的scFv，能明显减慢肿瘤的生长。何小鹃12、朱建高13等利用该技术成功构建了大肠癌噬菌体抗体库和鼻咽癌抗独特型抗体库，并从中筛选出全人源抗大肠癌单链抗体和鼻咽癌抗独特型单链抗体。我国研究者成功地从SARS病毒噬菌体抗体库中筛选出具有中和活性地抗S 蛋白Fab 片段抗体，体外实验证明其可部分中和SARS 病毒活性，能明显延缓细胞病变的过程14。1.3.2 转基因技术全人抗体还可以通过小鼠的基因工程免疫方法获得
13、。产生一免疫反应的基因工程敲除鼠，然后用杂交瘤技术使小鼠的脾细胞或淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。通过灭活内源性的小鼠抗体基因，然后引进人源抗体基因片段，当对人源抗体免疫的时候就可以在小鼠体内产生全人抗体分子。另一种方法是将人抗体基因微位点转入小鼠体内细胞，转染色体小鼠的免疫抗原基因环境和人类非常相似。还有一种不同的方法是向免疫供体或混合性严重免疫缺陷的小鼠注入人源淋巴细胞，通过抗原免疫使小鼠脾细胞融合骨髓瘤细胞15。 转基因小鼠制备的人抗体，其功效优于其他技术生产的抗正常人体蛋白单抗。小鼠识别抗原和动员抗原的抗体系统仍保持完整，容易把人体蛋白识别为异物。此外，由于抗体是体内产生的，经历了正常装配和
14、成熟过程，从而保证成品具有较高的靶结合亲和力。但转基因小鼠也存在一些缺陷，即转基因通常有体细胞突变和其他独特的序列，导致不完整的人序列；而且，由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单抗具有鼠糖基化的模式，所以这些单抗最终并不是全人源化的。因此，对人源化抗体的研究主要还是集中在嵌合抗体和CDR 移植抗体上。2 人源化抗体的表达2.1 大肠杆菌细菌是表达无糖基化蛋白的最理想工具，在所有细菌表达系统中，大肠杆菌表达系统被列为首选对象。但由于受其自身加工能力的限制，大肠杆菌不适合表达完整的抗体分子，大多用来选择性表达Fab或scFv等抗体片段。2.2 酵母自20 世纪80 年代初Hitizeman 等首
15、次运用酿酒酵母表达了人干扰素基因以来，运用酵母这种单细胞真核生物表达外源基因越来越受到重视，已建成了多种基因表达系统，表达出了多种蛋白质。巴斯德毕赤酵母表达系统已被证明是既可以用于分泌表达又可以用于细胞内表达外源基因的一个理想的酵母表达系统16，多形汉逊酵母是又一个成功的酵母表达系统，已用于表达乙型肝炎表面抗原等17，Kulkarni 等18用它可以开发一种新的低廉的乙肝疫苗。2.3 昆虫杆状病毒介导的表达系统是目前应用最广泛的昆虫表达系统。杆状病毒为环状双链DNA 病毒，具有严格的宿主专一性。以含多角体蛋白基因启动子的杆状病毒为载体的外源DNA，能在感染后的昆虫细胞培养基中高效表达。昆虫细胞
16、表达重组抗体有许多优点，如能进行翻译后修饰，抗体的活性较稳定、产量高、适用性强。进年来的研究成果显示17，杆状病毒表达系统非常适合生产用于临床诊断甚至治疗的抗体片段和完整的抗体。2.4 植物细胞 近年来，人们发现植物细胞中也能表达多种形式的抗体，其中包括表达重组人鼠嵌合抗体。植物细胞中有着与动物细胞相似的蛋白质合成、分泌、折叠及翻译后修饰途径，只是在蛋白质糖基化上与动物细胞略有差异。抗体能在植物的叶子和果实中表达，而不丢失其结合的特异性与亲和力19。2.5 哺乳动物细胞与原核细胞、酵母、细菌及昆虫细胞相比，以哺乳动物培养细胞作为宿主细胞，表达的蛋白最接近其天然构象，因而哺乳动物细胞表达系统成为生物工程制药较为理想的表达系统。在使用哺乳动物培养细胞表达抗体时，在蛋白合成起始信号、加工、分泌糖基化方面具有独特的优势，因此，大多数研究者都采用哺乳动物细
